组织样品质谱基猎枪蛋白造影学的综合工作流程
Summary
所述协议使用两种方法对组织样本进行优化定量蛋白学分析：基于标签和无标签量化。基于标签的方法具有更精确的蛋白质量化优势，而无标签方法更具成本效益，用于分析数百个组位样本。
Abstract
质谱学的最新进展导致深度蛋白石分析以及可生成的可靠和可重复的数据集的生成。然而，尽管技术取得了相当大的进步，但来自生物物种（如患者血液、CSF 和组织）的样品制备仍构成相当大的挑战。为了识别生物标志物，组织蛋白学通常提供一个有吸引力的样本来源，将研究结果从长凳翻译到诊所。它可以揭示癌症早期诊断和神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病等）的潜在候选生物标志物。组织蛋白质解毒学还根据蛋白质的丰富性产生丰富的系统信息，并有助于解决有趣的生物学问题。
定量蛋白学分析可分为两大类：基于标签的方法和无标签的方法。在基于标签的方法中，蛋白质或肽使用稳定的同位素（细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）或化学标签（如 ICAT（同位素编码亲和力标签）、TMT（串联质量标签）或 iTRAQ（用于相对和绝对定量的同质标记）进行标记。基于标签的方法具有更精确的蛋白质定量和使用同位素标签的优势，可以在一个实验中分析多个样本。无标签方法提供了基于标签的方法的具有成本效益的替代方案。根据临床特征，可以分析和比较属于特定组群的数百个患者样本，并与其他组别进行比较。在这里，我们描述了使用无标签和基于标签的蛋白质组分析方法为组织样本优化定量蛋白质组学工作流程，这对生命科学的应用至关重要，尤其是基于生物标志物的发现项目。
Introduction
蛋白造物学技术具有潜力，能够识别和量化潜在的候选标记，可以帮助检测和预测疾病1。质谱学领域的最新进展加速了蛋白质水平的临床研究。研究人员正试图利用质谱学蛋白质组学来应对多种疾病复杂病理生物学的挑战，这些蛋白质组学现在提高了蛋白质识别和定量2的灵敏度。蛋白质的精确定量测量对于理解健康人和患病个体蛋白质之间的动态和空间合作至关重要。然而，这种对蛋白质组范围的分析并不容易。
临床标本的蛋白体分析的一个主要局限性是生物样本的复杂性。研究了许多不同类型的样本来研究这种疾病的蛋白质组，如细胞系、血浆和组织4，5。细胞系被广泛用作体外实验的模型，以模拟疾病进展的不同阶段。然而，细胞系的一个主要局限性是，它们很容易在细胞培养过程中获得基因型和表型变化。体液，如血浆，可能是生物标志物发现的吸引力来源;然而，由于蛋白质高度丰富和蛋白质浓度的动态范围，血浆蛋白质解质学是有点更具挑战性的7。在这里，肽源自最丰富的蛋白质可以抑制那些从低富含蛋白质，即使质量/电荷比是相同的6。虽然在过去几年中，在耗竭和分馏技术方面取得了进步，但获得良好的覆盖范围仍然是等离子体蛋白学8、9的主要限制。更倾向于使用组织进行疾病生物学的蛋白体研究，因为组织样本与疾病部位最接近，并提供高生理和病理信息，以便更好地了解疾病生物学10，11。
在这份手稿中，我们为组织样本的定量蛋白学提供了简化的协议。我们使用了含有8M尿素的缓冲器进行组织解质制备，因为该缓冲器与基于质谱的调查相容。但是，在将盐注入质谱仪之前，必须清洁肽以去除盐分。需要记住的一个重要点是将尿素浓度降低到1米以下，然后加入蛋白消化的试丁二辛，因为试丁二酯在8M尿素浓度下表现出低活性。我们解释了两种定量全球定性定性学方法：使用 iTRAQ（用于相对和绝对量化的同质标记）和无标签量化 （LFQ） 进行基于标签的量化。基于 iTRAQ 的定量蛋白术主要用于比较多种生物条件不同的样本（例如，正常与疾病或经过处理的样本）。该方法利用异位试剂标记肽12的N终端原胺。iTRAQ试剂含有一个N-甲基管道拉齐辛记者组，一个平衡组，和一个N-羟基苏奇尼米德酯组，与肽13的N终端初级胺反应。从每个条件中消化的肽都标有特定的 iTRAQ 试剂。标记后，停止反应，将不同条件下的多肽标记为单管。这种组合样品混合物通过质谱仪进行分析，以进行识别和量化。经过MS/MS分析，生成分子质量低的记者离子片段，并利用这些记者离子的离子强度进行蛋白质的定量。
另一种方法是，无标签量化用于确定复杂样品中蛋白质的相对数量，而无需用稳定的同位素标记肽。
Protocol
Representative Results
Discussion
生物样本的组织蛋白解学使我们能够探索与疾病进展的不同阶段相关的新的潜在生物标志物。它还解释了信号和与疾病进展相关的通路机制。所述的组织定量蛋白学分析协议提供了可重复的良好覆盖数据。大部分步骤都根据制造商的说明进行了调整。为了获得高质量的数据，以下步骤最为关键。因此，在执行这些步骤时应给予额外的注意。
蛋白质的不完全消化和角蛋白的污?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们承认MHRD-UAY项目（UCHHATAR AVISHKAR YOJANA），该项目#34_IITB在生物技术部的支持下，在孟买国际信息技术研究所（BT/PR13114/INF/206/206/2015）进行所有MS相关实验。
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
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