Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido
Summary
El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.
Abstract
Los avances recientes en espectrometría de masas han dado como resultado un análisis proteómico profundo junto con la generación de conjuntos de datos robustos y reproducibles. Sin embargo, a pesar de los considerables avances técnicos, la preparación de muestras a partir de bioespecímenes como la sangre del paciente, el CSF y el tejido todavía plantea desafíos considerables. Para identificar biomarcadores, la proteómica tisular a menudo proporciona una fuente de muestra atractiva para traducir los hallazgos de la investigación del banco a la clínica. Puede revelar posibles biomarcadores candidatos para el diagnóstico precoz del cáncer y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, etc. La proteómica tisular también produce una gran cantidad de información sistémica basada en la abundancia de proteínas y ayuda a abordar preguntas biológicas interesantes.
El análisis proteómico cuantitativo se puede agrupar en dos grandes categorías: un enfoque basado en etiquetas y un enfoque sin etiquetas. En el enfoque basado en etiquetas, las proteínas o péptidos se etiquetan utilizando isótopos estables como SILAC (etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular) o mediante etiquetas químicas como ICAT (etiquetas de afinidad codificadas por isótopos), TMT (etiqueta de masa en tándem) o iTRAQ (etiqueta isobárica para cuantificación relativa y absoluta). Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas y, utilizando etiquetas isobáricas, se pueden analizar múltiples muestras en un solo experimento. El enfoque sin etiquetas proporciona una alternativa rentable a los enfoques basados en etiquetas. Cientos de muestras de pacientes pertenecientes a una cohorte en particular pueden ser analizadas y comparadas con otras cohortes en función de las características clínicas. Aquí, hemos descrito un flujo de trabajo de proteómica cuantitativa optimizada para muestras de tejido utilizando métodos de perfiles de proteoma sin etiquetas y basados en etiquetas, que es crucial para las aplicaciones en ciencias de la vida, especialmente los proyectos basados en el descubrimiento de biomarcadores.
Introduction
Las tecnologías proteómicas tienen el potencial de permitir la identificación y cuantificación de posibles marcadores candidatos que pueden ayudar en la detección y pronóstico de la enfermedad1. Los recientes avances en el campo de la espectrometría de masas han acelerado la investigación clínica a nivel de proteínas. Los investigadores están tratando de abordar el desafío de la patobiología complicada de varias enfermedades utilizando proteómica basada en espectrometría de masas, que ahora ofrece una mayor sensibilidad para la identificación y cuantificación de proteínas2. La medición cuantitativa precisa de las proteínas es crucial para comprender la cooperación dinámica y espacial entre las proteínas en individuos sanos y enfermos3; sin embargo, tal análisis a escala de proteoma no es fácil.
Una limitación importante del perfil proteómico de las muestras clínicas es la complejidad de las muestras biológicas. Se han investigado muchos tipos diferentes de muestras para estudiar el proteoma de la enfermedad, como líneas celulares, plasma y tejidos4,5. Las líneas celulares son ampliamente utilizadas como modelos en experimentos in vitro para imitar diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. Sin embargo, una limitación importante con las líneas celulares es que adquieren fácilmente cambios genotípicos y fenotípicos durante el proceso de cultivo celular6. Los fluidos corporales como el plasma podrían ser una fuente atractiva para el descubrimiento de biomarcadores; sin embargo, debido a las proteínas altamente abundantes y al rango dinámico de concentración de proteínas, la proteómica plasmática es un poco más desafiante7. Aquí, los péptidos originados a partir de las proteínas más abundantes pueden suprimir los derivados de las proteínas poco abundantes, incluso si la relación masa/carga es la misma6. Aunque ha habido avances en las tecnologías de agotamiento y fraccionamiento en los últimos años, obtener una buena cobertura sigue siendo una limitación importante de la proteómica plasmática8,9. Se prefiere el uso de tejidos para la investigación proteómica de la biología de la enfermedad, ya que las muestras de tejido son más proximales a los sitios de la enfermedad y ofrecen alta información fisiológica y patológica para proporcionar una mejor comprensión de la biología de la enfermedad10,11.
En este manuscrito, hemos proporcionado un protocolo simplificado para la proteómica cuantitativa de muestras de tejido. Hemos utilizado un tampón que contiene 8 M de urea para la preparación de lisato tisular, ya que este tampón es compatible con las investigaciones basadas en espectrometría de masas. Sin embargo, es obligatorio limpiar los péptidos para eliminar las sales antes de inyectarlas en el espectrómetro de masas. Un punto importante a recordar es reducir la concentración de urea a menos de 1 M antes de agregar tripsina para la digestión de proteínas, ya que la tripsina exhibe baja actividad a una concentración de urea de 8 M. Hemos explicado dos enfoques de la proteómica global cuantitativa: la cuantificación basada en etiquetas utilizando iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) y la cuantificación sin etiquetas (LFQ). La proteómica cuantitativa basada en iTRAQ se utiliza principalmente para comparar múltiples muestras que varían en su condición biológica (por ejemplo, muestras normales versus de enfermedades o tratadas). El enfoque utiliza reactivos isobáricos para etiquetar las aminas primarias N-terminales de los péptidos12. Los reactivos iTRAQ contienen un grupo reportero N-metil piperazina, un grupo equilibrador y un grupo éster N-hidroxi succinimida que reacciona con aminas primarias N-terminales de péptidos13. Los péptidos digeridos de cada afección se etiquetan con un reactivo iTRAQ particular. Después del etiquetado, la reacción se detiene y los péptidos etiquetados de diferentes condiciones se agrupan en un solo tubo. Esta mezcla de muestra combinada se analiza mediante espectrómetro de masas para su identificación y cuantificación. Después del análisis MS/MS, se generan fragmentos de iones reporteros con bajas masas moleculares y se utilizan las intensidades iónicas de estos iones reporteros para la cuantificación de las proteínas.
Otro enfoque, la cuantificación sin etiquetas, se utiliza para determinar el número relativo de proteínas en muestras complejas sin etiquetar péptidos con isótopos estables.
Protocol
Representative Results
Discussion
La proteómica tisular de muestras biológicas nos permite explorar nuevos biomarcadores potenciales asociados con diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. También explica el mecanismo de señalización y las vías asociadas con la progresión de la enfermedad. El protocolo descrito para el análisis proteómico cuantitativo de tejidos proporciona buenos datos de cobertura reproducibles. La mayoría de los pasos se han adaptado de las instrucciones del fabricante. Para obtener datos de alta calidad, los sig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos el Proyecto MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), proyecto #34_IITB a las instalaciones de SS y MASSFIITB en IIT Bombay con el apoyo del Departamento de Biotecnología (BT/PR13114/INF/22/206/2015) para llevar a cabo todos los experimentos relacionados con la EM.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
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