Doku Örneklerinin Kütle Spektrometresi Bazlı Av Tüfeği Proteomik Kapsamlı İş Akışı
Summary
Açıklanan protokol, iki yaklaşım kullanarak doku örneklerinin optimize edilmiş bir nicel proteomik analizini sağlar: etiket bazlı ve etiketsiz nicellik. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahipken, etiketsiz bir yaklaşım daha uygun maliyetlidir ve bir kohorttan yüzlerce örneği analiz etmek için kullanılır.
Abstract
Kütle spektrometreslerindeki son gelişmeler, sağlam ve tekrarlanabilir veri kümelerinin üretimiyle birlikte derin proteomik analizlerle sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, önemli teknik gelişmelere rağmen, hasta kanı, CSF ve doku gibi biyospepsimenlerden örnek hazırlama hala önemli zorluklar oluşturmaktadır. Biyobelirteçleri tanımlamak için, doku proteomik genellikle araştırma bulgularını kürsüden kliniğe çevirmek için çekici bir örnek kaynak sağlar. Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı gibi kanser ve nörodejeneratif hastalıkların erken tanısı için potansiyel aday biyobelirteçleri ortaya alabilir. Doku proteomik ayrıca proteinlerin bolluğuna dayanan çok sayıda sistemik bilgi verir ve ilginç biyolojik soruların ele alınmasına yardımcı olur.
Nicel proteomik analiz iki geniş kategoride gruplandırılabilir: etiket tabanlı ve etiketsiz bir yaklaşım. Etiket tabanlı yaklaşımda, proteinler veya peptitler SILAC (hücre kültüründe amino asitlerle kararlı izotop etiketlemesi) gibi kararlı izotoplar veya ICAT (izotop kodlu benzeşim etiketleri), TMT (tandem kütle etiketi) veya iTRAQ (göreceli ve mutlak nicelik için izobarik etiket) gibi kimyasal etiketler kullanılarak etiketlenir. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahiptir ve izobarik etiketler kullanılarak, tek bir deneyde birden fazla örnek analiz edilebilir. Etiketsiz yaklaşım, etiket tabanlı yaklaşımlara uygun maliyetli bir alternatif sağlar. Belirli bir kohorta ait yüzlerce hasta örneği, klinik özelliklere göre analiz edilebilir ve diğer kohortlarla karşılaştırılabilir. Burada, yaşam bilimlerindeki uygulamalar, özellikle biyobelirteç keşfi tabanlı projeler için çok önemli olan etiketsiz ve etiket tabanlı proteom profilleme yöntemlerini kullanan doku örnekleri için optimize edilmiş bir nicel proteomik iş akışı tanımladık.
Introduction
Proteomik teknolojiler, hastalığın tespiti ve prognostikasyonuna yardımcı olabilecek potansiyel aday belirteçlerinin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlama potansiyeline sahiptir1. Kütle spektrometresi alanındaki son gelişmeler protein düzeyinde klinik araştırmaları hızlandırmıştır. Araştırmacılar, şimdi protein tanımlama ve niceleme için daha fazla hassasiyet sunan kütle spektrometrisi bazlı proteomik kullanarak birkaç hastalığın karmaşık patobiyolojisinin zorluğunu ele almaya çalışıyorlar2. Proteinlerin doğru nicel ölçümü, sağlıklı ve hastalıklı bireylerde proteinler arasındaki dinamik ve mekansal işbirliğini anlamak için çok önemlidir3; ancak, proteome çapında bu tür bir analiz kolay değildir.
Klinik örneklerin proteomik profillemesinin önemli bir sınırlaması biyolojik örneklerin karmaşıklığıdır. Hücre hatları, plazma ve dokular4,5gibi hastalık proteomunun incelenmesi için birçok farklı örnek türü araştırılmıştır. Hücre hatları, hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarını taklit etmek için in vitro deneylerde model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, hücre hatları ile ilgili önemli bir sınırlama, hücre kültürü sürecinde genotipik ve fenotipik değişiklikleri kolayca edinmeleridir6. Plazma gibi vücut sıvıları biyobelirteç keşfi için çekici bir kaynak olabilir; bununla birlikte, oldukça bol proteinler ve dinamik protein konsantrasyonu aralığı nedeniyle, plazma proteomik biraz daha zordur7. Burada, en bol proteinlerden kaynaklanan peptitler, kütle / yük oranı aynı olsa bile düşük bol proteinlerden elde edilenleri bastırabilir6. Son birkaç yılda tükenme ve fraksiyonasyon teknolojilerinde gelişmeler olmasına rağmen, iyi kapsama almak hala plazma proteomik8,9‘un önemli bir sınırlaması olmaya devam etmektedir. Doku örnekleri hastalık bölgelerine en proksimal olduğu ve hastalık biyolojisi hakkında daha iyi içgörüler sağlamak için yüksek fizyolojik ve patolojik bilgiler sunduğu için dokuların hastalık biyolojisinin proteomik araştırılması için kullanılması tercih edilir10,11.
Bu yazıda doku örneklerinin nicel proteomikleri için basitleştirilmiş bir protokol sağladık. Bu tampon kütle spektrometresi bazlı incelemelerle uyumlu olduğu için doku lysate hazırlığı için 8 M üre içeren bir tampon kullandık. Bununla birlikte, tuzları kütle spektrometresine enjekte etmeden önce çıkarmak için peptitlerin temizlenmesi zorunludur. Unutulmaması gereken önemli bir nokta, trypsin 8 M üre konsantrasyonunda düşük aktivite sergilediğinden protein sindirimi için tripsin eklemeden önce üre konsantrasyonunu 1 M’nin altına düşürmektir. Nicel küresel proteomik iki yaklaşımı açıkladık: iTRAQ (göreceli ve mutlak niceleme için izobarik etiketler) ve etiketsiz nicelik (LFQ) kullanılarak etiket tabanlı nicelik. iTRAQ tabanlı nicel proteomik esas olarak biyolojik durumlarına göre değişen birden fazla numuneyi (örneğin, normal ve hastalık veya tedavi edilen örnekler) karşılaştırmak için kullanılır. Yaklaşım peptitlerin N-terminal birincil aminlerini etiketlemek için izobarik reaktifleri kullanır12. iTRAQ reaktifleri bir N-metil piperazin muhabir grubu, bir dengeleyici grubu ve N-terminal birincil peptit aminleri13ile reaksiyona sokulan bir N-hidroksi süksinid ester grubu içerir. Her durumdan sindirilmiş peptitler belirli bir iTRAQ reaktifi ile etiketlenir. Etiketlemenin ardından reaksiyon durdurulur ve farklı koşullardan etiketli peptitler tek bir tüpte biriktirilir. Bu kombine numune karışımı, tanımlama ve nicelik için kütle spektrometresi ile analiz edilir. MS/MS analizinden sonra düşük moleküler kütleli muhabir iyon parçaları üretilir ve proteinlerin nicelleştirilmesinde bu muhabir iyonlarının iyon yoğunlukları kullanılır.
Başka bir yaklaşım, etiketsiz niceleme, peptitleri kararlı izotoplarla etiketlemeden karmaşık numunelerdeki proteinlerin göreceli sayısını belirlemek için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biyolojik örneklerin doku proteomikleri, hastalığın ilerlemesinin farklı aşamalarıyla ilişkili yeni potansiyel biyobelirteçleri keşfetmemizi sağlar. Ayrıca sinyalizasyon mekanizmasını ve hastalığın ilerlemesiyle ilişkili yolları açıklar. Doku nicel proteomik analizi için açıklanan protokol tekrarlanabilir iyi kapsama verileri sağlar. Adımların çoğu üreticinin talimatlarından uyarlanmıştır. Yüksek kaliteli veri elde etmek için aşağıdaki adımlar çok önemlidir. Bu nedenle, bu adıml…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MS ile ilgili tüm deneyleri gerçekleştirmek için Biyoteknoloji Bölümü (BT/PR13114/INF/22/206/2015) tarafından desteklenen IIT Bombay’daki SS ve MASSFIITB Tesisi’ne #34_IITB MHRD-UAY Projesi’ni (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA) kabul ediyoruz.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
