Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters
Summary
Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.
Abstract
Recente ontwikkelingen in massaspectrometrie hebben geresulteerd in diepe proteomische analyse samen met het genereren van robuuste en reproduceerbare datasets. Ondanks de aanzienlijke technische vooruitgang vormt de monstervoorbereiding van biospecimens zoals patiëntenbloed, csf en weefsel echter nog steeds aanzienlijke uitdagingen. Voor het identificeren van biomarkers biedt weefselproteomics vaak een aantrekkelijke monsterbron om de onderzoeksresultaten van de bank naar de kliniek te vertalen. Het kan potentiële kandidaat-biomarkers onthullen voor vroege diagnose van kanker en neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, enz. Weefselproteomics levert ook een schat aan systemische informatie op basis van de overvloed aan eiwitten en helpt om interessante biologische vragen aan te pakken.
Kwantitatieve proteomics-analyse kan worden gegroepeerd in twee brede categorieën: een labelgebaseerde en een labelvrije aanpak. In de labelgebaseerde benadering worden eiwitten of peptiden gelabeld met behulp van stabiele isotopen zoals SILAC (stabiele isotoopetikettering met aminozuren in celkweek) of door chemische tags zoals ICAT (isotoopgecodeerde affiniteitstags), TMT (tandem mass tag) of iTRAQ (isobare tag voor relatieve en absolute kwantificering). Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten en met behulp van isobare labels kunnen meerdere monsters in één experiment worden geanalyseerd. De labelvrije aanpak biedt een kosteneffectief alternatief voor labelgebaseerde benaderingen. Honderden patiëntmonsters die tot een bepaald cohort behoren, kunnen worden geanalyseerd en vergeleken met andere cohorten op basis van klinische kenmerken. Hier hebben we een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-workflow beschreven voor weefselmonsters met behulp van labelvrije en labelgebaseerde proteoomprofileringsmethoden, wat cruciaal is voor toepassingen in de biowetenschappen, met name op biomarkerontdekking gebaseerde projecten.
Introduction
Proteomics-technologieën hebben het potentieel om de identificatie en kwantificering van potentiële kandidaat-markers mogelijk te maken die kunnen helpen bij de detectie en voorspelling van de ziekte1. Recente ontwikkelingen op het gebied van massaspectrometrie hebben het klinisch onderzoek op eiwitniveau versneld. Onderzoekers proberen de uitdaging van gecompliceerde pathobiologie van verschillende ziekten aan te pakken met behulp van op massaspectrometrie gebaseerde proteomica, die nu een verhoogde gevoeligheid biedt voor eiwitidentificatie en kwantificering2. Nauwkeurige kwantitatieve meting van eiwitten is cruciaal om de dynamische en ruimtelijke samenwerking tussen eiwitten bij gezonde en zieke individuen tebegrijpen 3; een dergelijke analyse op proteoombrede schaal is echter niet eenvoudig.
Een belangrijke beperking van proteomische profilering van klinische monsters is de complexiteit van biologische monsters. Veel verschillende soorten monsters zijn onderzocht om de ziekte proteoom te bestuderen, zoals cellijnen, plasma en weefsels4,5. Cellijnen worden veel gebruikt als modellen in in vitro experimenten om verschillende stadia van ziekteprogressie na te bootsen. Een belangrijke beperking met cellijnen is echter dat ze gemakkelijk genotypische en fenotypische veranderingen krijgen tijdens het proces van celkweek6. Lichaamsvloeistoffen zoals plasma kunnen een aantrekkelijke bron zijn voor de ontdekking van biomarkers; vanwege de zeer overvloedige eiwitten en het dynamische bereik van eiwitconcentratie is plasmaproteomics echter een beetje uitdagender7. Hier kunnen peptiden afkomstig van de meest voorkomende eiwitten die zijn afgeleid van de weinig voorkomende eiwitten onderdrukken, zelfs als de massa / ladingsverhouding hetzelfde is6. Hoewel er de afgelopen jaren vooruitgang is geboekt in de uitputtings- en fractioneringstechnologieën, blijft het verkrijgen van een goede dekking nog steeds een belangrijke beperking van plasmaproteomics8,9. Het gebruik van weefsels voor proteomisch onderzoek van ziektebiologie heeft de voorkeur omdat weefselmonsters het meest proximaal zijn voor de ziekteplaatsen en hoge fysiologische en pathologische informatie bieden om betere inzichten in de ziektebiologie te bieden10,11.
In dit manuscript hebben we een vereenvoudigd protocol gegeven voor de kwantitatieve proteomics van weefselmonsters. We hebben een buffer met 8 M ureum gebruikt voor het weefsellysaatpreparaat, omdat deze buffer compatibel is met op massaspectrometrie gebaseerd onderzoek. Het is echter verplicht om de peptiden te reinigen om zouten te verwijderen voordat ze in de massaspectrometer worden geïnjecteerd. Een belangrijk punt om te onthouden is om de ureumconcentratie te verlagen tot minder dan 1 M voordat trypsine wordt toegevoegd voor eiwitvertering, omdat trypsine een lage activiteit vertoont bij een ureumconcentratie van 8 M. We hebben twee benaderingen van kwantitatieve wereldwijde proteomics uitgelegd: labelgebaseerde kwantificering met behulp van iTRAQ (isobare tags voor relatieve en absolute kwantificering) en labelvrije kwantificering (LFQ). De op iTRAQ gebaseerde kwantitatieve proteomics wordt voornamelijk gebruikt voor het vergelijken van meerdere monsters die variëren in hun biologische toestand (bijv. Normale versus ziekte of behandelde monsters). De aanpak maakt gebruik van isobare reagentia om de N-terminale primaire amines van peptiden te labelen12. De iTRAQ-reagentia bevatten één N-methyl piperazine reportergroep, een balancergroep en één N-hydroxy succinimide-estergroep die reageert met N-terminale primaire amines van peptiden13. Verteerde peptiden van elke aandoening worden gelabeld met een bepaald iTRAQ-reagens. Na de etikettering wordt de reactie gestopt en worden gelabelde peptiden uit verschillende omstandigheden samengevoegd in een enkele buis. Dit gecombineerde monstermengsel wordt geanalyseerd met een massaspectrometer voor identificatie en kwantificering. Na de MS/MS-analyse worden reporter-ionfragmenten met lage moleculaire massa’s gegenereerd en worden de ionenintensiteiten van deze reporterionen gebruikt voor de kwantificering van de eiwitten.
Een andere benadering, labelvrije kwantificering, wordt gebruikt om het relatieve aantal eiwitten in complexe monsters te bepalen zonder peptiden te labelen met stabiele isotopen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Weefselproteomica van biologische monsters stelt ons in staat om nieuwe potentiële biomarkers te verkennen die verband houden met verschillende stadia van ziekteprogressie. Het verklaart ook het mechanisme van signalering en routes geassocieerd met ziekteprogressie. Het beschreven protocol voor weefsel kwantitatieve proteomics analyse biedt reproduceerbare goede dekkingsgegevens. De meeste stappen zijn aangepast aan de instructies van de fabrikant. Om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen, zijn de volgende stappen h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), project #34_IITB SS en MASSFIITB Facility in IIT Bombay ondersteund door het Department of Biotechnology (BT / PR13114 / INF / 22/206/2015) om alle MS-gerelateerde experimenten uit te voeren.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
