Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto
Summary
Il protocollo descritto fornisce un’analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.
Abstract
I recenti progressi nella spettrometria di massa hanno portato a un’analisi proteomica profonda insieme alla generazione di set di dati robusti e riproducibili. Tuttavia, nonostante i notevoli progressi tecnici, la preparazione del campione da parte di biocampimenti come il sangue del paziente, il CSF e il tessuto pone ancora sfide considerevoli. Per identificare i biomarcatori, la proteomica tissutale spesso fornisce un’interessante fonte di campioni per tradurre i risultati della ricerca dal banco alla clinica. Può rivelare potenziali biomarcatori candidati per la diagnosi precoce del cancro e delle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, ecc. La proteomica tissutale produce anche una ricchezza di informazioni sistemiche basate sull’abbondanza di proteine e aiuta ad affrontare interessanti questioni biologiche.
L’analisi proteomica quantitativa può essere raggruppata in due grandi categorie: un approccio basato su etichette e un approccio privo di etichette. Nell’approccio basato sull’etichetta, le proteine o i peptidi sono etichettati utilizzando isotopi stabili come SILAC (etichettatura isotopica stabile con amminoacidi in coltura cellulare) o da tag chimici come ICAT (tag di affinità codificati con isotopi), TMT (tag di massa tandem) o iTRAQ (tag isobarico per la quantificazione relativa e assoluta). Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine e utilizzando etichette isobariche, è possibile analizzare più campioni in un singolo esperimento. L’approccio senza etichette fornisce un’alternativa economica agli approcci basati sulle etichette. Centinaia di campioni di pazienti appartenenti a una particolare coorte possono essere analizzati e confrontati con altre coorti in base alle caratteristiche cliniche. Qui, abbiamo descritto un flusso di lavoro di proteomica quantitativa ottimizzato per campioni di tessuto utilizzando metodi di profilazione del proteoma privi di etichette e basati su etichette, che è fondamentale per le applicazioni nelle scienze della vita, in particolare i progetti basati sulla scoperta di biomarcatori.
Introduction
Le tecnologie di proteomica hanno il potenziale per consentire l’identificazione e la quantificazione di potenziali marcatori candidati che possono aiutare nella rilevazione e nella prognosi della malattia1. I recenti progressi nel campo della spettrometria di massa hanno accelerato la ricerca clinica a livello proteico. I ricercatori stanno cercando di affrontare la sfida della patobiologia complicata di diverse malattie utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa, che ora offre una maggiore sensibilità per l’identificazione e la quantificazione delle proteine2. Una misurazione quantitativa accurata delle proteine è fondamentale per comprendere la cooperazione dinamica e spaziale tra le proteine in individui sani e malati3; tuttavia, tale analisi su scala proteoma non è facile.
Uno dei principali limiti della profilazione proteomica dei campioni clinici è la complessità dei campioni biologici. Molti diversi tipi di campioni sono stati studiati per studiare il proteoma della malattia, come linee cellulari, plasma e tessuti4,5. Le linee cellulari sono ampiamente utilizzate come modelli in esperimenti in vitro per imitare diversi stadi di progressione della malattia. Tuttavia, una delle principali limitazioni con le linee cellulari è che acquisiscono facilmente cambiamenti genotipici e fenotipici durante il processo di coltura cellulare6. I fluidi corporei come il plasma potrebbero essere una fonte interessante per la scoperta di biomarcatori; tuttavia, a causa delle proteine molto abbondanti e della gamma dinamica di concentrazione proteica, la proteomica plasmatica è un po ‘più impegnativa7. Qui, i peptidi originati dalle proteine più abbondanti possono sopprimere quelli derivati dalle proteine a bassa abbondanza anche se il rapporto massa/carica è lo stesso6. Sebbene ci siano stati progressi nelle tecnologie di esaurimento e frazionamento negli ultimi anni, ottenere una buona copertura rimane ancora una delle principali limitazioni della proteomicaplasmatica 8,9. L’uso di tessuti per l’indagine proteomica della biologia della malattia è preferito in quanto i campioni di tessuto sono più prossimali ai siti di malattia e offrono elevate informazioni fisiologiche e patologiche per fornire migliori informazioni sulla biologia della malattia10,11.
In questo manoscritto, abbiamo fornito un protocollo semplificato per la proteomica quantitativa di campioni di tessuto. Abbiamo utilizzato un tampone contenente 8 M di urea per la preparazione del lisato tissutale in quanto questo tampone è compatibile con le indagini basate sulla spettrometria di massa. Tuttavia, è obbligatorio pulire i peptidi per rimuovere i sali prima di iniettarli nello spettrometro di massa. Un punto importante da ricordare è quello di ridurre la concentrazione di urea a meno di 1 M prima di aggiungere tripsina per la digestione delle proteine poiché la tripsina mostra una bassa attività a 8 M di concentrazione di urea. Abbiamo spiegato due approcci di proteomica globale quantitativa: la quantificazione basata su etichette utilizzando iTRAQ (tag isobarici per la quantificazione relativa e assoluta) e la quantificazione senza etichetta (LFQ). La proteomica quantitativa basata su iTRAQ viene utilizzata principalmente per confrontare più campioni che variano nelle loro condizioni biologiche (ad esempio, campioni normali rispetto a campioni di malattia o trattati). L’approccio utilizza reagenti isobarici per etichettare le ammine primarie N-terminali dei peptidi12. I reagenti iTRAQ contengono un gruppo reporter N-metil piperazina, un gruppo bilanciatore e un gruppo estere N-idrossi succinimide che reagisce con le ammine primarie N-terminali dei peptidi13. I peptidi digeriti da ciascuna condizione sono etichettati con un particolare reagente iTRAQ. Dopo l’etichettatura, la reazione viene interrotta e i peptidi etichettati da diverse condizioni vengono raggruppati in un singolo tubo. Questa miscela di campioni combinati viene analizzata dallo spettrometro di massa per l’identificazione e la quantificazione. Dopo l’analisi MS/MS, vengono generati frammenti ioniche reporter con basse masse molecolari e le intensità ioniche di questi ioni reporter vengono utilizzate per la quantificazione delle proteine.
Un altro approccio, la quantificazione senza etichetta, viene utilizzato per determinare il numero relativo di proteine in campioni complessi senza etichettare peptidi con isotopi stabili.
Protocol
Representative Results
Discussion
La proteomica tissutale di campioni biologici ci consente di esplorare nuovi potenziali biomarcatori associati a diversi stadi di progressione della malattia. Spiega anche il meccanismo di segnalazione e le vie associate alla progressione della malattia. Il protocollo descritto per l’analisi proteomica quantitativa dei tessuti fornisce dati riproducibili di buona copertura. La maggior parte dei passaggi sono stati adattati dalle istruzioni del produttore. Per ottenere dati di alta qualità, i seguenti passaggi sono fonda…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo mhrd-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), progetto #34_IITB a SS e MASSFIITB Facility presso IIT Bombay supportato dal Dipartimento di Biotecnologie (BT / PR13114 / INF / 22/206/ 2015) per effettuare tutti gli esperimenti relativi alla SM.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
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