זרימת עבודה מקיפה של פרוטאומיקת רובה ציד מבוססת ספקטרומטריה של דגימות רקמה
Summary
הפרוטוקול המתואר מספק ניתוח פרוטאומי כמותי ממוטב של דגימות רקמה באמצעות שתי גישות: כמות מבוססת תווית וללא תווית. לגישות מבוססות תוויות יש יתרון של כמות מדויקת יותר של חלבונים, בעוד שגישה נטולת תוויות חסכונית יותר ומשמשת לניתוח מאות דגימות של קבוצה.
Abstract
ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסה הביאה לניתוח פרוטאומי עמוק יחד עם יצירת ערכות נתונים חזקות ושחזוריות. עם זאת, למרות ההתקדמות הטכנית ניכרת, הכנת מדגם מ biospecimens כגון דם המטופל, CSF, ורקמות עדיין מציב אתגרים ניכרים. לזיהוי סמנים ביולוגיים, פרוטאומיקה של רקמות מספקת לעתים קרובות מקור מדגם אטרקטיבי לתרגום ממצאי המחקר מהספסל למרפאה. זה יכול לחשוף סמנים ביולוגיים מועמד פוטנציאלי לאבחון מוקדם של סרטן ומחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, וכו ‘. פרוטאומייקה של רקמות גם מניבה שפע של מידע מערכתי המבוסס על שפע החלבונים ומסייעת לענות על שאלות ביולוגיות מעניינות.
ניתן לקבץ ניתוח פרוטאומיה כמותית לשתי קטגוריות רחבות: גישה מבוססת תוויות וגישה נטולת תוויות. בגישה המבוססת על תוויות, חלבונים או פפטידים מסומנים באמצעות איזוטופים יציבים כגון SILAC (תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו בתרבות התאים) או על ידי תגים כימיים כגון ICAT (תגי זיקה מקודדים איזוטופ), TMT (תג מסה דו-מושבי) או iTRAQ (תג איזוברי לכמות יחסית ומוחלטת). גישות מבוססות תוויות יש את היתרון של כמות מדויקת יותר של חלבונים באמצעות תוויות איזובריות, דגימות מרובות ניתן לנתח בניסוי אחד. הגישה נטולת התוויות מספקת חלופה חסכונית לגישות מבוססות תוויות. ניתן לנתח ולהשוות מאות דגימות מטופלים השייכות לקבוצה מסוימת ולהשוותן לקבוצות אחרות המבוססות על תכונות קליניות. כאן, תיארנו זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ממוטבת עבור דגימות רקמה באמצעות שיטות פרופיל פרוטאום ללא תוויות ומבוססות תוויות, החיוניות ליישומים במדעי החיים, במיוחד פרויקטים מבוססי גילוי סמנים ביולוגיים.
Introduction
טכנולוגיות פרוטאומיקס יש פוטנציאל לאפשר זיהוי וכימות של סמנים מועמד פוטנציאליים שיכולים לסייע באיתור וחיזוי של המחלה1. ההתקדמות האחרונה בתחום ספקטרומטריית המסה האיצה את המחקר הקליני ברמת החלבון. חוקרים מנסים להתמודד עם האתגר של פתוביולוגיה מסובכת של מספר מחלות באמצעות פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית, אשר מציעה כעת רגישות מוגברת לזיהוי וכימות חלבונים2. מדידה כמותית מדויקת של חלבונים חיונית להבנת שיתוף הפעולה הדינמי והמרחבי בין חלבונים אצל אנשים בריאים וחולים3; עם זאת, ניתוח כזה בקנה מידה רחב פרוטאום אינו קל.
מגבלה מרכזית אחת של פרופיל פרוטאומי של דגימות קליניות היא המורכבות של דגימות ביולוגיות. סוגים רבים ושונים של דגימות נחקרו כדי לחקור את פרוטאום המחלה, כגון קווי תאים, פלזמה, ורקמות4,5. קווי תאים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים בניסויי במבחנה כדי לחקות שלבים שונים של התקדמות המחלה. עם זאת, מגבלה מרכזית אחת עם קווי תאים היא שהם רוכשים בקלות שינויים גנוטיפיים ופנוטיפיים במהלך התהליך של תרבית התא6. נוזלי גוף כגון פלזמה יכולים להיות מקור אטרקטיבי לגילוי סמן ביולוגי; עם זאת, בשל חלבונים שופעים מאוד ואת הטווח הדינמי של ריכוז חלבון, פרוטאומיקה פלזמה הוא קצת יותר מאתגר7. כאן, פפטידים שמקורם בחלבונים הנפוצים ביותר יכולים לדכא את אלה שמקורם בחלבונים השופעים הנמוכים גם אם יחס המסה /מטען זהה ל-6. למרות שהיו התקדמות בטכנולוגיות דלדול ופירוק בשנים האחרונות, קבלת כיסוי טוב עדיין נותר מגבלה גדולה של פרוטאומיקספלזמה 8,9. השימוש ברקמות לחקירה פרוטאומית של ביולוגיה של המחלה עדיף שכן דגימות רקמה הן הקרובות ביותר לאתרי המחלה ומציעות מידע פיזיולוגי ופתולוגי גבוה כדי לספק תובנות טובות יותר על ביולוגיית המחלה10,11.
בכתב יד זה, סיפקנו פרוטוקול פשוט יותר עבור פרוטאומיקה כמותית של דגימות רקמה. השתמשנו במאגר המכיל 8 M אוריאה להכנת ליסאט רקמה כמו חוצץ זה תואם עם חקירות מבוססות ספקטרומטריית מסה. עם זאת, חובה לנקות את הפפטידים כדי להסיר מלחים לפני הזרקת אותם לתוך ספקטרומטר המסה. נקודה חשובה לזכור היא להפחית את ריכוז אוריאה לפחות מ 1 M לפני הוספת טריפסין לעיכול חלבון כמו טריפסין תערוכות פעילות נמוכה בריכוז 8 M אוריאה. הסברנו שתי גישות של פרוטאומיקה גלובלית כמותית: כימות מבוסס תווית באמצעות iTRAQ (תגים איזובריים לכימות יחסית ומוחלטת) וכימות ללא תוויות (LFQ). הפרוטאומיקה הכמותית המבוססת על iTRAQ משמשת בעיקר להשוואת דגימות מרובות המשתנות במצבן הביולוגי (למשל, נורמלי לעומת מחלה או דגימות מטופלות). הגישה משתמשת ריאגנטים איזובריים כדי לתייג את אמינים ראשיים N-terminal של פפטידים12. ריאגנטים iTRAQ מכילים קבוצת כתבים N-מתיל פיפראזין אחת, קבוצת מאזן, וקבוצת אסתר תמציתית N-הידרוקסית שמגיבה עם אמינים ראשוניים N-terminal של פפטידים13. פפטידים מעוכלים מכל תנאי מסומנים עם ריאגנט iTRAQ מסוים. לאחר התיוג, התגובה נעצרת ו מתויג פפטידים מתנאים שונים מחולקים לתוך צינור אחד. תערובת מדגם משולבת זו מנותחת על ידי ספקטרומטר מסה לזיהוי וכימות. לאחר ניתוח MS / MS, רסיסי יונים עיתונאיים עם מסות מולקולריות נמוכות נוצרים ועוצמות היונים של יונים עיתונאיים אלה משמשות לכימות החלבונים.
גישה נוספת, כימות ללא תוויות משמש כדי לקבוע את המספר היחסי של חלבונים בדגימות מורכבות מבלי לסמן פפטידים עם איזוטופים יציבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטאומייקה של רקמות של דגימות ביולוגיות מאפשרת לנו לחקור סמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים הקשורים לשלבים שונים של התקדמות המחלה. זה גם מסביר את מנגנון האיתות והמסלולים הקשורים להתקדמות המחלה. הפרוטוקול המתואר לניתוח פרוטאומי כמותי של רקמות מספק נתוני כיסוי טובים לשחזור. רוב השלבים הו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בפרויקט MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), פרויקט #34_IITB למתקן SS ו- MASSFIITB ב- IIT בומביי הנתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה (BT / PR13114/ INF / 22/206/2015) לביצוע כל הניסויים הקשורים ל- MS.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
