Fluxo de trabalho abrangente da proteômica de espingarda baseada em espectrometria de massa de amostras de tecido
Summary
O protocolo descrito fornece uma análise de proteômica quantitativa otimizada das amostras de tecido usando duas abordagens: quantitação baseada em rótulos e sem rótulos. As abordagens baseadas em rótulos têm a vantagem de uma quantitação mais precisa de proteínas, enquanto uma abordagem sem rótulos é mais econômica e usada para analisar centenas de amostras de uma coorte.
Abstract
Os recentes avanços na espectrometria de massa resultaram em análises proteômicas profundas, juntamente com a geração de conjuntos de dados robustos e reprodutíveis. No entanto, apesar dos avanços técnicos consideráveis, a preparação amostral de bioespecímenos como sangue do paciente, CSF e tecido ainda representa desafios consideráveis. Para identificar biomarcadores, a proteômica tecidual geralmente fornece uma fonte amostral atraente para traduzir os achados da pesquisa do banco para a clínica. Pode revelar potenciais biomarcadores candidatos para o diagnóstico precoce de câncer e doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, etc. A proteômica tecidual também produz uma riqueza de informações sistêmicas baseadas na abundância de proteínas e ajuda a abordar questões biológicas interessantes.
A análise quantitativa da proteômica pode ser agrupada em duas categorias amplas: uma abordagem baseada em rótulos e uma abordagem sem rótulos. Na abordagem baseada em rótulos, proteínas ou peptídeos são rotulados usando isótopos estáveis como SILAC (rotulagem estável de isótopos com aminoácidos na cultura celular) ou por marcas químicas como ICAT (tags de afinidade codificadas por isótopos), TMT (marca de massa tandem) ou iTRAQ (tag isobárica para quantitação relativa e absoluta). Abordagens baseadas em rótulos têm a vantagem de uma quantificação mais precisa de proteínas e usando rótulos isobáricos, várias amostras podem ser analisadas em um único experimento. A abordagem sem rótulos fornece uma alternativa econômica às abordagens baseadas em rótulos. Centenas de amostras de pacientes pertencentes a uma coorte em particular podem ser analisadas e comparadas com outras coortes baseadas em características clínicas. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho de proteômica quantitativa otimizado para amostras de tecido usando métodos de perfil proteome sem rótulos e baseados em rótulos, que é crucial para aplicações em ciências da vida, especialmente projetos baseados em descobertas de biomarcadores.
Introduction
As tecnologias de proteômica têm o potencial de permitir a identificação e quantificação de potenciais marcadores candidatos que possam auxiliar na detecção e prognóstico da doença1. Os recentes avanços no campo da espectrometria de massa aceleraram a pesquisa clínica no nível da proteína. Pesquisadores estão tentando enfrentar o desafio da complicada civilologia de várias doenças usando proteômica baseada em espectrometria de massa, que agora oferece maior sensibilidade para identificação e quantificação de proteínas2. A medição quantitativa precisa das proteínas é crucial para compreender a cooperação dinâmica e espacial entre proteínas em indivíduos saudáveis e doentes3; no entanto, essa análise em larga escala não é fácil.
Uma das principais limitações do perfil proteômico dos espécimes clínicos é a complexidade das amostras biológicas. Muitos tipos diferentes de amostras têm sido investigados para estudar a doença proteome, como linhas celulares, plasma e tecidos4,5. As linhas celulares são amplamente utilizadas como modelos em experimentos in vitro para imitar diferentes estágios de progressão da doença. No entanto, uma grande limitação com as linhas celulares é que elas facilmente adquirem alterações genotípicas e fenotípicas durante o processo de cultura celular6. Fluidos corporais como o plasma podem ser uma fonte atraente para a descoberta de biomarcadores; no entanto, devido às proteínas altamente abundantes e à amplitude dinâmica da concentração de proteínas, a proteômica plasmática é um pouco mais desafiadora7. Aqui, os peptídeos originados das proteínas mais abundantes podem suprimir aqueles derivados das proteínas de baixa abundância, mesmo que a relação massa/carga seja a mesma6. Embora tenha havido avanços nas tecnologias de esgotamento e fracionamento nos últimos anos, obter uma boa cobertura ainda continua sendo uma grande limitação da proteômica plasmática8,9. O uso de tecidos para investigação proteômica da biologia da doença é preferido, pois as amostras de tecido são mais proximais aos locais da doença e oferecem altas informações fisiológicas e patológicas para fornecer melhores insights sobre a biologia da doença10,11.
Neste manuscrito, fornecemos um protocolo simplificado para a proteômica quantitativa das amostras de tecido. Usamos um tampão contendo 8 M de ureia para a preparação do tecido, pois este buffer é compatível com investigações baseadas em espectrometria de massa. No entanto, é obrigatório limpar os peptídeos para remover sais antes de injetá-los no espectrômetro de massa. Um ponto importante a ser lembrado é reduzir a concentração de ureia para menos de 1 M antes de adicionar trippsina para digestão proteica, pois a trippsina exibe baixa atividade na concentração de 8 M de ureia. Explicamos duas abordagens de proteômica global quantitativa: quantificação baseada em rótulos usando iTRAQ (tags isobáricas para quantificação relativa e absoluta) e quantificação sem rótulos (LFQ). A proteômica quantitativa baseada em iTRAQ é usada principalmente para comparar múltiplas amostras variando em sua condição biológica (por exemplo, normal versus doença ou amostras tratadas). A abordagem utiliza reagentes isobáricos para rotular as aminas primárias n-terminal de peptídeos12. Os reagentes iTRAQ contêm um grupo de repórteres de n-metil piperazina, um grupo balanceador, e um grupo de éster de succinimida N-hidroxy que reage com aminas primárias N-terminal de peptídeos13. Peptídeos digeridos de cada condição são rotulados com um reagente iTRAQ específico. Após a rotulagem, a reação é interrompida e peptídeos rotulados de diferentes condições são agrupados em um único tubo. Esta mistura de amostra combinada é analisada por espectrômetro de massa para identificação e quantificação. Após a análise de MS/MS, fragmentos de íons repórteres com baixas massas moleculares são gerados e as intensidades de íons desses repórteres são usadas para a quantificação das proteínas.
Outra abordagem, quantificação sem rótulos é usada para determinar o número relativo de proteínas em amostras complexas sem rotular peptídeos com isótopos estáveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
A proteômica tecidual de amostras biológicas nos permite explorar novos biomarcadores potenciais associados a diferentes estágios de progressão da doença. Também explica o mecanismo de sinalização e caminhos associados à progressão da doença. O protocolo descrito para análise de proteômica quantitativa tecidual fornece dados de boa cobertura reprodutíveis. A maioria das etapas foram adaptadas a partir das instruções do fabricante. Para obter dados de alta qualidade, as etapas a seguir são mais cruciais. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconhecemos o Projeto MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), projeto #34_IITB para ss e massfiitb facility na IIT Bombay apoiado pelo Departamento de Biotecnologia (BT/PR13114/INF/22/206/2015) para realizar todos os experimentos relacionados ao MS.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
