Комплексный рабочий процесс протеомики образцов тканей на основе масс-спектрометрии
Summary
Описанный протокол обеспечивает оптимизированный количественный протеомический анализ образцов тканей с использованием двух подходов: на основе меток и свободного количественного определения меток. Подходы, основанные на этикетках, имеют преимущество в более точном количественном анализе белков, в то время как подход без маркировки является более экономически эффективным и используется для анализа сотен образцов когорты.
Abstract
Последние достижения в области масс-спектрометрии привели к глубокому протеомическому анализу наряду с созданием надежных и воспроизводимых наборов данных. Однако, несмотря на значительные технические достижения, подготовка образцов из биообразцов, таких как кровь пациента, ликвор и ткани, по-прежнему создает значительные проблемы. Для выявления биомаркеров тканевая протеомика часто обеспечивает привлекательный источник образцов для перевода результатов исследований со стенда в клинику. Он может выявить потенциальные биомаркеры-кандидаты для ранней диагностики рака и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и т. Д. Тканевая протеомика также дает богатую системную информацию, основанную на обилии белков, и помогает решать интересные биологические вопросы.
Количественный анализ протеомики можно сгруппировать в две широкие категории: подход, основанный на маркировке, и подход без меток. В подходе, основанном на маркировке, белки или пептиды мечятся с использованием стабильных изотопов, таких как SILAC (маркировка стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре) или химическими метками, такими как ICAT (метки аффинности с кодированием изотопов), TMT (тандемная массовая метка) или iTRAQ (изобарическая метка для относительного и абсолютного количественного определения). Подходы, основанные на этикетках, имеют преимущество в более точном количественном обозначении белков и использовании изобарических меток, несколько образцов могут быть проанализированы в одном эксперименте. Подход без маркировки обеспечивает экономически эффективную альтернативу подходам, основанным на маркировке. Сотни образцов пациентов, принадлежащих к определенной когорте, могут быть проанализированы и сопоставлены с другими когортами на основе клинических особенностей. Здесь мы описали оптимизированный рабочий процесс количественной протеомики для образцов тканей с использованием методов профилирования протеомов без этикеток и на основе этикеток, что имеет решающее значение для приложений в науках о жизни, особенно в проектах, основанных на обнаружении биомаркеров.
Introduction
Технологии протеомики обладают потенциалом для идентификации и количественной оценки потенциальных маркеров-кандидатов, которые могут помочь в выявлении и прогнозировании заболевания1. Последние достижения в области масс-спектрометрии ускорили клинические исследования на уровне белка. Исследователи пытаются решить проблему сложной патобиологии нескольких заболеваний с помощью протеомики на основе масс-спектрометрии, которая теперь предлагает повышенную чувствительность для идентификации и количественной оценки белка2. Точное количественное измерение белков имеет решающее значение для понимания динамического и пространственного сотрудничества между белками у здоровых и больных людей3; однако такой анализ в масштабах всего протеома непрост.
Одним из основных ограничений протеомного профилирования клинических образцов является сложность биологических образцов. Для изучения протеома заболевания было исследовано много различных типов образцов, таких как клеточные линии, плазма иткани 4,5. Клеточные линии широко используются в качестве моделей в экспериментах in vitro для имитации различных стадий прогрессирования заболевания. Однако одним из основных ограничений клеточных линий является то, что они легко приобретают генотипические и фенотипические изменения в процессе клеточной культуры6. Жидкости организма, такие как плазма, могут быть привлекательным источником для открытия биомаркеров; однако из-за большого количества белков и динамического диапазона концентрации белка протеомика плазмы немного сложнее7. Здесь пептиды, полученные из наиболее распространенных белков, могут подавлять те, которые получены из низкообильного количества белков, даже если соотношение масса/заряд равно6. Хотя в последние несколько лет были достигнуты успехи в технологиях истощения и фракционирования, получение хорошего охвата по-прежнему остается основным ограничением плазменной протеомики8,9. Использование тканей для протеомного исследования биологии заболевания является предпочтительным, поскольку образцы тканей наиболее близки к местам заболевания и предлагают высокую физиологическую и патологическую информацию, чтобы обеспечить лучшее понимание биологии заболевания10,11.
В этой рукописи мы предоставили упрощенный протокол количественной протеомики образцов тканей. Мы использовали буфер, содержащий 8 М мочевины для приготовления тканевого лисата, поскольку этот буфер совместим с исследованиями на основе масс-спектрометрии. Однако обязательно очищают пептиды для удаления солей перед введением их в масс-спектрометр. Одним из важных моментов, который следует помнить, является снижение концентрации мочевины до менее чем 1 М перед добавлением трипсина для переваривания белка, поскольку трипсин проявляет низкую активность при концентрации мочевины 8 М. Мы объяснили два подхода к количественной глобальной протеомике: количественную оценку на основе меток с использованием iTRAQ (изобарические метки для относительной и абсолютной количественной оценки) и количественную оценку без меток (LFQ). Количественная протеомика на основе iTRAQ в основном используется для сравнения нескольких образцов, различающихся по их биологическому состоянию (например, нормальные и больные или обработанные образцы). Подход использует изобарические реагенты для маркировки N-концевые первичные аминыпептидов 12. Реагенты iTRAQ содержат одну репортерную группу N-метилпиперазина, группу балансировщика и одну группу эфира N-гидроксисукцинимида, которая реагирует с N-концевыми первичными аминамипептидов 13. Переваренные пептиды из каждого состояния маркируются определенным реагентом iTRAQ. После маркировки реакция останавливается и меченые пептиды из разных условий объединяются в одну трубку. Эта комбинированная смесь образцов анализируется масс-спектрометром для идентификации и количественной оценки. После анализа MS/MS генерируются фрагменты репортерных ионов с низкими молекулярными массами и для количественной оценки белков используются интенсивности ионов-репортеров.
Другой подход, количественная оценка без меток, используется для определения относительного числа белков в сложных образцах без маркировки пептидов стабильными изотопами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Тканевая протеомика биологических образцов позволяет исследовать новые потенциальные биомаркеры, связанные с различными стадиями прогрессирования заболевания. Это также объясняет механизм передачи сигналов и пути, связанные с прогрессированием заболевания. Описанный протокол кол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем проект MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), проект #34_IITB для SS и MASSFIITB Facility в IIT Bombay при поддержке Департамента биотехнологии (BT/PR13114/INF/22/206/2015) для проведения всех экспериментов, связанных с MS.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
