ऊतक नमूनों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित शॉटगन प्रोटेओमिक्स का व्यापक कार्यप्रवाह
Summary
वर्णित प्रोटोकॉल दो दृष्टिकोणों का उपयोग करके ऊतक नमूनों का एक अनुकूलित मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण प्रदान करता है: लेबल-आधारित और लेबल मुक्त क्वांटिटेशन। लेबल आधारित दृष्टिकोण प्रोटीन के अधिक सटीक मात्रा का लाभ है, जबकि एक लेबल मुक्त दृष्टिकोण अधिक लागत प्रभावी है और एक पलटन के नमूनों के सैकड़ों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया ।
Abstract
बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री में हाल की प्रगति के परिणामस्वरूप मजबूत और प्रजनन योग्य डेटासेट की पीढ़ी के साथ-साथ गहरे प्रोटेओमिक विश्लेषण हुए हैं। हालांकि, काफी तकनीकी प्रगति के बावजूद, रोगी रक्त, सीएसएफ और ऊतक जैसे बायोस्पेसिमेन से नमूना तैयारी अभी भी काफी चुनौतियां बन गई है। बायोमार्कर की पहचान करने के लिए, ऊतक प्रोटेओमिक्स अक्सर बेंच से क्लिनिक में अनुसंधान निष्कर्षों का अनुवाद करने के लिए एक आकर्षक नमूना स्रोत प्रदान करता है। यह कैंसर और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग आदि के शीघ्र निदान के लिए संभावित उम्मीदवार बायोमार्कर प्रकट कर सकता है। ऊतक प्रोटेओमिक्स भी प्रोटीन की बहुतायत के आधार पर प्रणालीगत जानकारी का खजाना पैदावार और दिलचस्प जैविक सवालों को संबोधित करने में मदद करता है ।
मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स विश्लेषण को दो व्यापक श्रेणियों में बांटा जा सकता है: एक लेबल-आधारित और लेबल-मुक्त दृष्टिकोण। लेबल-आधारित दृष्टिकोण में, प्रोटीन या पेप्टाइड्स को स्थिर आइसोटोप जैसे एसिलैक (सेल कल्चर में अमीनो एसिड के साथ स्थिर आइसोटोप लेबलिंग) या आईसीएटी (आइसोटोप-कोडित एफ़िनिटी टैग), टीएमटी (टैंडेम मास टैग) या आईएआरएक्यू (सापेक्ष और पूर्ण क्वांटिटेशन के लिए आइसोकरिक टैग) जैसे रासायनिक टैग द्वारा लेबल किया जाता है। लेबल-आधारित दृष्टिकोणों में प्रोटीन के अधिक सटीक मात्रा का लाभ होता है और आइसोकरिक लेबल का उपयोग करके, एक ही प्रयोग में कई नमूनों का विश्लेषण किया जा सकता है। लेबल-मुक्त दृष्टिकोण लेबल-आधारित दृष्टिकोणों के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करता है। एक विशेष पलटन से संबंधित रोगी नमूनों के सैकड़ों विश्लेषण किया जा सकता है और नैदानिक सुविधाओं के आधार पर अन्य साथियों के साथ तुलना में। यहां, हमने लेबल-मुक्त और लेबल-आधारित प्रोटेओम प्रोफाइलिंग विधियों का उपयोग करके ऊतक नमूनों के लिए एक अनुकूलित मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो का वर्णन किया है, जो जीवन विज्ञान, विशेष रूप से बायोमार्कर खोज आधारित परियोजनाओं में अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है।
Introduction
प्रोटेओमिक्स प्रौद्योगिकियों में संभावित उम्मीदवार मार्कर की पहचान और मात्रा को सक्षम करने की क्षमता है जो रोग का पता लगाने और शकुन में सहायता कर सकते हैं1। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के क्षेत्र में हाल की प्रगति ने प्रोटीन स्तर पर नैदानिक अनुसंधान में तेजी लाई है। शोधकर्ता बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटेओमिक्स का उपयोग करके कई बीमारियों के जटिल रोगविज्ञान की चुनौती का समाधान करने की कोशिश कर रहे हैं, जो अब प्रोटीन पहचान और मात्रा2के लिए बढ़ी हुई संवेदनशीलता प्रदान करता है । प्रोटीन का सटीक मात्रात्मक मापन स्वस्थ और रोगग्रस्त व्यक्तियों में प्रोटीन के बीच गतिशील और स्थानिक सहयोग को समझने के लिए महत्वपूर्ण है3. हालांकि, प्रोटेम-वाइड पैमाने पर इस तरह का विश्लेषण आसान नहीं है।
नैदानिक नमूनों की प्रोटेओमिक प्रोफाइलिंग की एक प्रमुख सीमा जैविक नमूनों की जटिलता है। कई विभिन्न प्रकार के नमूनों की जांच की गई है, जैसे सेल लाइन्स, प्लाज्मा, औरऊतकों 4,5जैसे रोग प्रोटेम का अध्ययन करने के लिए। कोशिका लाइनों को व्यापक रूप से रोग प्रगति के विभिन्न चरणों की नकल करने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। हालांकि, सेल लाइनों के साथ एक प्रमुख सीमा यह है कि वे सेल संस्कृति 6 की प्रक्रिया के दौरान आसानी से जीनोटिपिक और फेनोटाइपिक परिवर्तन प्राप्तकरतेहैं। प्लाज्मा जैसे शरीर के तरल पदार्थ बायोमार्कर खोज के लिए एक आकर्षक स्रोत हो सकते हैं; हालांकि, अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन और प्रोटीन एकाग्रता की गतिशील रेंज के कारण, प्लाज्मा प्रोटेओमिक्स थोड़ा और अधिक चुनौतीपूर्ण7है . यहां, पेप्टाइड्स सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन से उत्पन्न कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन से प्राप्त उन लोगों को दबा सकते हैं, भले ही द्रव्यमान/प्रभारी अनुपात एक ही6है । यद्यपि पिछले कुछ वर्षों में कमी और अंश प्रौद्योगिकियों में प्रगति हुई है, लेकिन अच्छी कवरेज प्राप्त करना अभी भी प्लाज्मा प्रोटेओमिक्स8,9की एक प्रमुख सीमा बनी हुई है। रोग जीव विज्ञान की प्रोटेओमिक जांच के लिए ऊतकों के उपयोग को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि ऊतक के नमूने रोग स्थलों के लिए सबसे समीपस्थ होते हैं और रोग जीव विज्ञान10,11में बेहतर अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए उच्च शारीरिक और रोग संबंधी जानकारी प्रदान करते हैं ।
इस पांडुलिपि में, हमने ऊतक नमूनों के मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल प्रदान किया है। हमने टिश्यू लिएट तैयार करने के लिए 8 एम यूरिया युक्त बफर का इस्तेमाल किया है क्योंकि यह बफर मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित जांच के साथ संगत है। हालांकि, पेप्टाइड्स को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्शन लगाने से पहले लवण को हटाने के लिए साफ करना अनिवार्य है। याद रखने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु प्रोटीन पाचन के लिए ट्राइप्सिन जोड़ने से पहले यूरिया एकाग्रता को 1 मीटर से कम करना है क्योंकि ट्राइप्सिन 8 एम यूरिया एकाग्रता पर कम गतिविधि प्रदर्शित करता है। हमने मात्रात्मक वैश्विक प्रोटेओमिक्स के दो दृष्टिकोणों की व्याख्या की है: iTRAQ (सापेक्ष और पूर्ण मात्राकरण के लिए आइसोकरिक टैग) और लेबल-मुक्त क्वांटिफिकेशन (एलएफक्यू) का उपयोग करके लेबल-आधारित मात्राकरण। आईआरएक्यू-आधारित मात्रात्मक प्रोटेओमिक्स का उपयोग मुख्य रूप से उनकी जैविक स्थिति (जैसे, सामान्य बनाम रोग या उपचारित नमूनों) में भिन्न कई नमूनों की तुलना करने के लिए किया जाता है। यह दृष्टिकोण पेप्टाइड्स12के एन-टर्मिनल प्राइमरी अमीनों को लेबल करने के लिए आइसोकरिक रिएजेंट्स का उपयोग करता है। आईट्रैका अभिकर्मकों में एक एन-मिथाइल पिपराज़ीन रिपोर्टर समूह, एक बैलेंसर समूह और एक एन-हाइड्रोक्सी सक्सिमाइड एस्टर समूह होता है जो पेप्टाइड्स13के एन-टर्मिनल प्राइमरी अमीनों के साथ प्रतिक्रिया करता है । प्रत्येक स्थिति से पचा पेप्टाइड्स एक विशेष iTRAQ अभिकर्ती के साथ लेबल कर रहे हैं। लेबलिंग के बाद, प्रतिक्रिया बंद कर दी जाती है और विभिन्न स्थितियों से पेप्टाइड्स लेबल को एक ही ट्यूब में जमा किया जाता है। इस संयुक्त नमूना मिश्रण पहचान और मात्राकरण के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा विश्लेषण किया जाता है। एमएस/एमएस विश्लेषण के बाद, कम आणविक जनता के साथ रिपोर्टर आयन टुकड़े उत्पन्न होते हैं और इन रिपोर्टर आयनों की आयन तीव्रता का उपयोग प्रोटीन की मात्रा के लिए किया जाता है ।
एक अन्य दृष्टिकोण, लेबल-मुक्त मात्राकरण का उपयोग स्थिर आइसोटोप के साथ पेप्टाइड्स लेबलिंग के बिना जटिल नमूनों में प्रोटीन की सापेक्ष संख्या निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैविक नमूनों के ऊतक प्रोटेओमिक्स हमें रोग प्रगति के विभिन्न चरणों से जुड़े नए संभावित बायोमार्कर का पता लगाने में सक्षम बनाता है। इसमें सिग्नलिंग के तंत्र और रोग प्रगति से जुड़े रास्तों के बारे में भ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एमएस से संबंधित सभी प्रयोगों को पूरा करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी विभाग (बीटी/PR13114/INF/22/206/2015) द्वारा समर्थित आईआईटी बॉम्बे में एसएस और मासफिट्ब सुविधा के लिए #34_IITB एमएचआरडी-यूएवाई परियोजना (उछतर एविक योजना) को स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
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