Omfattende arbeidsflyt av massespektrometribasert hagleproteomikk av vevsprøver
Summary
Den beskrevne protokollen gir en optimalisert kvantitativ proteomikkanalyse av vevsprøver ved hjelp av to tilnærminger: etikettbasert og etikettfri kvantasjon. Etikettbaserte tilnærminger har fordelen av mer nøyaktig mengde proteiner, mens en etikettfri tilnærming er mer kostnadseffektiv og brukes til å analysere hundrevis av prøver av en kohort.
Abstract
Nylige fremskritt innen massespektrometri har resultert i dyp proteomisk analyse sammen med generering av robuste og reproduserbare datasett. Til tross for de betydelige tekniske fremskrittene, gir prøvepreparering fra biospecimens som pasientblod, CSF og vev fortsatt betydelige utfordringer. For å identifisere biomarkører gir vevsproteomikk ofte en attraktiv prøvekilde for å oversette forskningsfunnene fra benken til klinikken. Det kan avsløre potensielle kandidatbiomarkører for tidlig diagnose av kreft og nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, etc. Vevsproteomikk gir også et vell av systemisk informasjon basert på overflod av proteiner og bidrar til å løse interessante biologiske spørsmål.
Kvantitativ proteomikkanalyse kan grupperes i to brede kategorier: en etikettbasert og en etikettfri tilnærming. I den etikettbaserte tilnærmingen er proteiner eller peptider merket med stabile isotoper som SILAC (stabil isotopmerking med aminosyrer i cellekulturen) eller av kjemiske koder som ICAT (isotopkodede affinitetskoder), TMT (tandemmassemerke) eller iTRAQ (isobarisk tag for relativ og absolutt kvantitet). Etikettbaserte tilnærminger har fordelen av mer nøyaktig mengde proteiner og ved hjelp av isobariske etiketter, kan flere prøver analyseres i et enkelt eksperiment. Den etikettfrie tilnærmingen gir et kostnadseffektivt alternativ til etikettbaserte tilnærminger. Hundrevis av pasientprøver som tilhører en bestemt kohort kan analyseres og sammenlignes med andre kohorter basert på kliniske egenskaper. Her har vi beskrevet en optimalisert kvantitativ proteomisk arbeidsflyt for vevsprøver ved hjelp av etikettfrie og etikettbaserte proteomprofileringsmetoder, som er avgjørende for anvendelser i biovitenskap, spesielt biomarkøroppdagelsesbaserte prosjekter.
Introduction
Proteomiske teknologier har potensial til å muliggjøre identifisering og kvantifisering av potensielle kandidatmarkører som kan hjelpe til med deteksjon og prognostisering av sykdommen1. Nylige fremskritt innen massespektrometri har akselerert klinisk forskning på proteinnivå. Forskere prøver å løse utfordringen med komplisert patobiologi av flere sykdommer ved hjelp av massespektrometribasert proteomikk, som nå gir økt følsomhet for proteinidentifikasjon og kvantifisering2. Nøyaktig kvantitativ måling av proteiner er avgjørende for å forstå det dynamiske og romlige samarbeidet mellom proteiner hos friske og syke individer3; Imidlertid er en slik analyse på en proteome-bred skala ikke lett.
En stor begrensning ved proteomisk profilering av kliniske prøver er kompleksiteten i biologiske prøver. Mange forskjellige typer prøver har blitt undersøkt for å studere sykdommen proteom, for eksempel cellelinjer, plasma og vev4,5. Cellelinjer er mye brukt som modeller i in vitro-eksperimenter for å etterligne ulike stadier av sykdomsprogresjon. En stor begrensning med cellelinjer er imidlertid at de lett får genotypiske og fenotypiske endringer under prosessen med cellekultur6. Kroppsvæsker som plasma kan være en attraktiv kilde for biomarkøroppdagelse; På grunn av de svært rikelige proteinene og det dynamiske spekteret av proteinkonsentrasjon, er plasmaproteomikk imidlertid litt mer utfordrende7. Her stammer peptider fra de mest tallrike proteinene kan undertrykke de som er avledet fra de lave rikelige proteinene, selv om masse / ladningsforholdet er det samme6. Selv om det har vært fremskritt i uttømmings- og fraksjoneringsteknologiene de siste årene, er det fortsatt en stor begrensning av plasmaproteomikk8,9. Bruk av vev for proteomisk undersøkelse av sykdomsbiologi foretrekkes da vevsprøver er mest proksimale for sykdomsstedene og tilbyr høy fysiologisk og patologisk informasjon for å gi bedre innsikt i sykdomsbiologien10,11.
I dette manuskriptet har vi gitt en forenklet protokoll for kvantitativ proteomikk av vevsprøver. Vi har brukt en buffer som inneholder 8 M urea for vevslyspreparatet, da denne bufferen er kompatibel med massespektrometribaserte undersøkelser. Det er imidlertid obligatorisk å rengjøre peptidene for å fjerne salter før du injiserer dem i massespektrometeret. Et viktig poeng å huske er å redusere ureakonsentrasjonen til mindre enn 1 M før du legger til trypsin for protein fordøyelse som trypsin viser lav aktivitet ved 8 M urea konsentrasjon. Vi har forklart to tilnærminger til kvantitativ global proteomikk: etikettbasert kvantifisering ved hjelp av iTRAQ (isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering) og etikettfri kvantifisering (LFQ). ITRAQ-basert kvantitativ proteomikk brukes hovedsakelig til å sammenligne flere prøver som varierer i deres biologiske tilstand (f.eks. normal versus sykdom eller behandlede prøver). Tilnærmingen benytter isobariske reagenser for å merke N-terminal primære aminer av peptider12. ITRAQ-reagensene inneholder en N-metyl piperazinreportergruppe, en balansergruppe og en N-hydroksy succinimide estergruppe som reagerer med N-terminal primære aminer av peptider13. Fordøyde peptider fra hver tilstand er merket med et bestemt iTRAQ-reagens. Etter merkingen stoppes reaksjonen og merkede peptider fra forskjellige forhold samles i et enkelt rør. Denne kombinerte prøveblandingen analyseres av massespektrometer for identifisering og kvantifisering. Etter MS/MS-analysen genereres reporterionfragmenter med lave molekylære masser, og ionintensitetene til disse reporterionene brukes til kvantifisering av proteinene.
En annen tilnærming, etikettfri kvantifisering, brukes til å bestemme det relative antallet proteiner i komplekse prøver uten å merke peptider med stabile isotoper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vevsproteomikk av biologiske prøver gjør det mulig for oss å utforske nye potensielle biomarkører forbundet med ulike stadier av sykdomsprogresjon. Det forklarer også mekanismen for signalering og veier forbundet med sykdomsprogresjon. Den beskrevne protokollen for vevse kvantitativ proteomikkanalyse gir reproduserbare gode dekningsdata. De fleste trinnene er tilpasset produsentens instruksjoner. For å få data av høy kvalitet er følgende trinn mest avgjørende. Derfor bør det utvises ekstra forsiktighet mens du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkjenner MHRD-UAY Project (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA), prosjekt #34_IITB til SS og MASSFIITB Facility ved IIT Bombay støttet av Institutt for bioteknologi (BT/PR13114/INF/22/206/2015) for å utføre alle MS-relaterte eksperimenter.
Materials
| Reagents | |||
| Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
| Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
| Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
| Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
| Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
| Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
| Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
| Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
| MS grade water | Pierce | 51140 | |
| Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
| Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Tris Base | Merck | 648310 | |
| Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Urea | Merck | MB1D691237 | |
| Supplies | |||
| Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
| Micropipettes | Gilson | F167380 | |
| Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
| Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
| Equipment | |||
| Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
| Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
| pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
| Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
| Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
| Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
| Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
| Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
| Software | |||
| Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
References
- Petricoin, E., Wulfkuhle, J., Espina, V., Liotta, L. A. Clinical proteomics: revolutionizing disease detection and patient tailoring therapy. Journal of Proteome Research. 3 (2), 209-217 (2004).
- Geho, D. H., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Blasting into the microworld of tissue proteomics: a new window on cancer. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 10 (3), 825-827 (2004).
- Hashimoto, Y., Greco, T. M., Cristea, I. M. Contribution of mass spectrometry-based proteomics to discoveries in developmental biology. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1140, 143-154 (2019).
- Faria, S. S., et al. A timely shift from shotgun to targeted proteomics and how it can be groundbreaking for cancer research. Frontiers in Oncology. 7, 13 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics. 11 (11), 2139-2161 (2011).
- Chen, E. I., Yates, J. R. Cancer proteomics by quantitative shotgun proteomics. Molecular Oncology. 1 (2), 144-159 (2007).
- Geyer, P. E., Holdt, L. M., Teupser, D., Mann, M. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Ray, S., et al. Proteomic analysis of Plasmodium falciparum induced alterations in humans from different endemic regions of India to decipher malaria pathogenesis and identify surrogate markers of severity. Journal of Proteomics. 127, 103-113 (2015).
- Ray, S., et al. Clinicopathological analysis and multipronged quantitative proteomics reveal oxidative stress and cytoskeletal proteins as possible markers for severe vivax malaria. Scientific Reports. 6, 24557 (2016).
- Sharma, S., et al. Multipronged quantitative proteomic analyses indicate modulation of various signal transduction pathways in human meningiomas. Proteomics. 15 (2-3), 394-407 (2015).
- Sharma, S., Ray, S., Moiyadi, A., Sridhar, E., Srivastava, S. Quantitative proteomic analysis of meningiomas for the identification of surrogate protein markers. Scientific Reports. 4, 7140 (2014).
- Aslam, B., Basit, M., Nisar, M. A., Khurshid, M., Rasool, M. H. Proteomics: Technologies and their applications. Journal of Chromatographic Science. 55 (2), 182-196 (2017).
- Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research. Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).
- Rudnick, P. A., et al. A description of the Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) common data analysis pipeline. Journal of Proteome Research. 15 (3), 1023-1032 (2016).
