Summary
マルチカラムプレートアダプタにより、クロマトグラフィーカラムを並列アフィニティーまたはイオン交換精製用のマルチウェルコレクションプレートとインターフェースして、経済的に高スループットのタンパク質精製方法を提供します。それは現実的な器械使用によって蛋白質のミリグラム量を得る重力または真空の下で使用することができる。
Abstract
タンパク質の精製は、タンパク質の構造と機能の研究に不可欠であり、通常、生物物理学的手法と組み合わせて使用されます。また、新しい治療薬の開発における重要な要素でもあります。機能性プロテオミクスの進化する時代は、これを容易にするための高スループットタンパク質精製と改良された技術の需要を促進しています。マルチカラムプレートアダプタ(MCPA)は、並列精製のためにマルチウェルプレートを持つ異なる樹脂の複数のクロマトグラフィーカラムをインターフェースできると仮定しました。この方法は、自動化されたシステムの速度に匹敵する、重力または真空の下で使用することができるタンパク質精製の経済的で汎用性の高い方法を提供する。MCPA は、その後の特性評価と分析のための手頃な価格と時間効率の高い方法によってタンパク質のミリグラムの収率を回復するために使用できます。.MCPAはSH3ドメインのハイスループットアフィニティー精製のために使用されている。また、MCPAを介してイオン交換が実証され、タンパク質ポストNi-NTAアフィニティークロマトグラフィーを精製し、このシステムを他の精製タイプにどのように適合させることができるかを示しています。複数の列を使用した設定により、パラメータの個別カスタマイズは同じ精製で行うことができます。
Introduction
精製タンパク質のミリグラム量を達成するためのタンパク質精製技術は、特にNMRなどの生物物理学的方法において、その特性評価と分析に不可欠です。タンパク質精製は、創薬プロセスやタンパク質とタンパク質相互作用の研究など、他の研究分野の中心でもあります。しかし、このような純粋なタンパク質の量を達成することは、これらの技術1、2、3のボトルネックになる可能性があります。タンパク質精製の主な方法は、タンパク質の個々の特性とそのタグに依存する様々な方法を含むクロマトグラフィーです。アフィニティークロマトグラフィーにおいて、タンパク質は、クロマトグラフィー樹脂4上の特定の基質に対する親和性を有するタグとして働く追加のタンパク質またはペプチドモチーフを有する。最も一般的な親和性法は、Hisタグ付きタンパク質を用いた固定化金属親和クロマトグラフィー(IMAC)であるのに対し、別の一般的な方法は、その電荷に基づいてタンパク質を分離するイオン交換クロマトグラフィーである。高純度のため、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換の組み合わせが頻繁に使用され、通常は高スループットのために高価なラボ機器が必要です。
機能性プロテオミクスの進化する時代は、特定の分析のために単数形のタンパク質ではなく、多数のタンパク質を同時に精製して包括的な解析とゲノム全体の研究のために、ハイスループット技術の需要を促進している5。固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)は、高スループットタンパク質精製6、7に最も広く使用されている方法の1つですが、その自動化システムは、より小さな実験室8のために高価で手頃な価格です。現在利用可能な、より手頃な価格のプレートベースの代替品は、真空などのアクセス可能な実験室ベースの機器の使用を採用しています。これらの方法は精製速度の向上に成功しているが、より小さなスケールでしか高スループット精製を達成でき、マイクログラム範囲でタンパク質を生み出すだけである。これらの制限は、プレパックされた96ウェルフィルタープレート(例えば、Cytivaが現在所有しているGEヘルスケアから)を生物物理学的技術の前に使用できないことを意味します。重力クロマトグラフィーは、最もコスト効率の高い精製方法です。ただし、複数の列を設定するのは不便であり、複数のタンパク質ではエラーが発生しやすくなります。
マルチカラムプレートアダプタ(MCPA)が開発され、一度に平行アフィニティークロマトグラフィーカラムを正常かつ便利に実行し、Hisタグ付き酵母SH3ドメイン10を精製することが実証されています。MCPAは費用がかかる器械使用に依存しない費用効率の高い高い効率の精製方法を提供する。その柔軟な設計は、重力または真空マニホールドの下で複数の親和性クロマトグラフィーカラムによって効果的にタンパク質のミリグラムを精製することができます。さらに、樹脂の種類、体積、およびその他のパラメータを個々のカラムごとに調整して、最適化を高速化することができます。この研究は、MCPAによるイオン交換クロマトグラフィーがMCPAによるアフィニティークロマトグラフィーと組み合わせて使用され、Abp1 SH3ドメインの精製を強化できることを示している。さらに、これらの方法を用いて、最大24種類のタンパク質を並列に分離することができます。
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Protocol
1. ニNTAクロマトグラフィーの変性
- バッファの準備
注: すべてのバッファの詳細については 、表 1 を参照してください。- 500 mL の 0.5 M NaOH を構成し、最初にミリ-Q水を加え、ビーカーがスターラーに乗っている間にゆっくりと NaOH を加えます。0.22 μm フィルターを使用してフィルターします。
- 0.22 μmフィルターを使用して、0.1 Mの硫酸ニッケルとフィルターの100 mLを準備します。
- 0.22 μm フィルターを使用して、2 M イミダゾールとフィルターの 50 mL を準備します。
- 調製し、0.22 μmフィルター 5.3 mM Tris-HCl、4.7 mMトリスベース(トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミン)、13.7 mM NaH2PO 4、86.3 mM Na2HPO4および6 Mグアニ塩酸塩からなるpH 8.0で変性バッファーの1.5 L。
- 調製し、2 M イミダゾールストックを使用して変性バッファーに溶解 10 mM イミダゾールの 溶解バッファー 溶液の 500 mL の溶解バッファー溶液の 0.22 μm フィルターを準備します。.
- 調製し、2 M イミダゾールストックを使用して変性バッファーに溶解 10 mM イミダゾールの 洗浄バッファー 溶液の 500 mLの 0.22 μm フィルターを準備します(1.1.4を参照)。
- 準備し、100 mM EDTAバッファーの500 mLのフィルタ500 μmLを準備し、1 M NaOHを使用してpHを8に調整します。
- 調製し、6 Mグアニジン塩酸塩に99%氷酢酸の7 mLから構成される 溶出バッファー の500 mLを調製します。
メモ: ネイティブバッファを使用する場合は、 表1に従って調整してください。
- 細胞をライジング(変性法)
- 過剰発現Hisタグ付きタンパク質を含む収穫された 大腸菌 細胞ペレットの1gごとに2mLのライシスバッファーを加える。細胞が再び懸濁されるまで数分間渦。サンプルはロッカーに4°Cで30分間放置します。
- 遠心分離機は18,000 x gで30分間ペレットを取り付けた。50 μL を-20 °Cの冷凍庫に入れ、後でSDS-PAGEゲルで分析します。
- ペレットが乱れていないことを確認する上清を慎重に注ぎます。ライセートは、明るい黄色にする必要があります。ライセートが曇っている場合は、遠心分離機サンプルを再び。核酸を分解するために利用可能な場合は超音波処理を検討してください。
- 空の列(樹脂なしが、フィルタ付き)を通して上清をフィルタリングし、開いたコレクショントレイに集めます。その後、ステップ1.3で使用するためにチューブに移します。
注:ネイティブバッファを使用する場合は、ステップ1.2.1の後、-80°Cでフリーズ/解凍の3サイクルにサンプルを扱うか、超音波処理またはフランスプレスで細胞をライスするプロセス。
- 真空浄化の準備とカラムの平衡化
注: 参照 図 1 24 列の設定用 MCPA。- 必要な列数、および必要な樹脂の種類とボリュームを決定します。T7ベースのプラスミドを用いたHisタグ付きSH3ドメインを発現する100mLの自己誘導培養(〜2gペレット)の経験則として、約6mLのライセートから約3mgのタンパク質を得るために、1カラムあたり0.6mLのNi-NTA樹脂を使用する。
- 必要な数の12 mLカラム(樹脂なしがフィルタ付き)を、あらかじめ組み立てたMCPA(穿刺シールマット付きロングドリッププレート)に挿入します。柱は穿刺されたシーリングマットの穴にぴったりと収まるべきである。
- 使用する列が 24 列未満の場合は、空の空の穴を閉じて空の列を閉じます。
- 開いたコレクションプレートを取り、真空マニホールドのベースにこのプレートを入れ、マニホールドの上部で閉じます。
- 真空マニホールドの上にコラムを持つ組み立てたMCPAを置きます。
- 真空ポンプシステムのチューブを真空マニホールドの底部の入口/ノズルに取り付けます。
- Ni-NTAビーズが20%エタノールで50%溶液に入っていることを確認してください。ビーズで何かをする前に、ビーズ/エタノール溶液を穏やかに振る/混ぜて均等に再中断します。次いで、5 mL ピペットを用い、50%溶液のピペット1.2 mLをカラムに入れて行った。ピペットしながら、ビーズが完全に混合されたままであることを確認してください。
- 24個のカラムすべてにピペットを入れた後、真空ポンプをオンにし、20%エタノールをカラムを通して、下のコレクションプレートに入れます。
- すべての20%エタノールがすべてのカラムを通過したら、ポンプの電源を切ります(ニNTA樹脂は、バッファーがカラムを通過した後も真空が適用されている場合は、短時間の乾燥を許容できます)。開いた回収プレートの中にあるものを廃棄物箱に捨てなさい。
注意: Ni-NTAビーズからの廃棄物はすべて、ビーズの取り扱いや廃棄物の処分、手袋、ゴーグル、その他のPPEを着用する際に危険です。さらに、すべての硫酸ニッケル廃棄物を別の容器に入れ、後で個別に処分してください。
注: 樹脂が新しい場合や最近再生された場合は、残りの手順は無視して次のセクションに進んでください。 - 20 mL のシリンジまたは 50 mL シリンジを備えたリピーターシリンジ装置を使用して、100 mM EDTA バッファーの樹脂容積(1.8 mL)を 3 個追加します。次に、真空ポンプのスイッチを入れ、EDTAバッファを洗浄し、洗浄したらポンプをオフにします。
注:この洗浄は、ニッケル青の色を削除する必要がありますが、この場合は、すべての列が青い色を失うまで、この手順を繰り返します。ポンプをオフにし、廃棄物ボックスに開いたコレクションプレートの内容物を注ぎます。 - 0.5 M NaOHバッファの樹脂容積(1.8 mL)を各カラムに加えてから、ポンプをオンにして各列を通して実行します。空のコレクションプレート。
- 各カラム に4つの樹脂容積 (2.4mL)の 硫酸ニッケル を加えます。真空ポンプをオンにして、もう一度カラムを通してこれを実行します。
- ミリ-Q水の樹脂の体積(約6000μL)を10個加え、カラムを通してこれを実行します。ポンプをオフにして、回収プレートの内容物をゴミ箱に注ぎます。
- 4 つの樹脂容積 (2.4 mL)の 10 mMイミダゾールを洗浄バッファー( 変性または天然)で2回洗浄し、余分なニッケルを取り除き、平衡化します。空のコレクションプレート。
注: 列の実行速度が著しく遅い場合は、柱を取り外し、大きなシリンジを使用して MCPA を通して空気を押し抜くことができます。ブロックされていない場合は、新しいフィルターで別の列を使用します。 - MCPA上で複数の異なるサンプル/タンパク質を精製する場合は、開いたコレクションプレートを48 x(5 mL/well)コレクションプレートに置き換えてください。しかし、すべてのカラムで同じタンパク質サンプルのみを実行する場合は、開いたコレクションプレートを使用して実行しても問題ありません。
- ローディング、洗浄、溶出
- 真空をオフにすると、ローセートをカラムにロードします(ライセートの量は通常1〜12mL以上で変化し、いくつかのバッチでロードする必要があります)。薄いプラスチック製のスターラーを使用して、ビーズとライセートを列にそっと混ぜて結合を最大化します。
- 各カラムを数分間静かに混合した後、真空ポンプのスイッチを入れ、列を通してライセートを実行します。複数のタンパク質サンプルが実行されている場合は、48ウェルコレクションプレートを使用し、4 mLが通過した後、これらのプレートのウェルが4mLの溶液しか保持できないので、別の48ウェルプレートの回収プレートを交換してください。すべてのライセートが列を通って実行されるまで、ライセートの実行を続けます。フロースルーを含むコレクション プレートをフリーズします。
注: 列が「ブロック」され、ライセートが列を通る速度が必要以上に遅くなる場合があります。隣接する列が通常の速度で流れるので、これは簡単に見つかります。この場合は、新しいフィルターを含むカラムに、ライセート/樹脂混合物を移すことをお勧めします。 - 回収プレートを空の開いた回収プレートに交換し、10 mMイミダゾール洗浄バッファーの9つの樹脂ボリューム(5.4 mL)を各カラムに追加し、真空をオンにして洗浄を実行します。これを4~5回繰り返します。オーバーフローを避けるために、定期的に空の廃プレート。
- その後、回収プレートをクリーンな適切なプレートに置き換えます(1つのタンパク質のみのオープンプレートと、複数のタンパク質がある場合は96ウェルで、A1が左上隅に存在することを確認します)。
- 12.5 mLシリンジを有するリピータシリンジを用いて、各カラムに変性溶出バッファーのピペット〜1樹脂容積(0.75mL)を用いた。
- タンパク質の発泡を避けるために、最も低い設定で真空ポンプをオンにします。MCPAをそっと持ち上げて、コレクションプレートに滴り落ちるものが残っていないかどうかを確認します。
注: 真空または重力で溶出する代わりに、10 mL シリンジ プランジャーを柱の上部に押し込んで、溶出バッファーを柱に静かに押し込む方法があります。すべての列でこれを行い、シリンジプランジャーを取り外す際には、列の下部にあるビーズを邪魔しないように注意してください。溶出バッファーが押し通されたら、使用した最後の列からシリンジ プランジャーをそっと取り出し、真空ポンプを短時間オンにして、カラムから最後の滴を取り除きます。- 96ウェルのコレクションプレートを使用している場合は、コレクションプレートをチェックして、各カラムから長い点滴板を通って流れているものが1つの井戸に流れ込むだけで、コレクションプレートの隣接する井戸に溶け出すものがないことを確認してください。
- 次の溶出のために上記の2つのステップを繰り返し、新鮮なマルチウェル(異なるサンプル)または開いたコレクションプレート(同じサンプル)に集めます。
- 任意ステップは、純度および濃度分析のために各溶出の50 μLアリコートを取る。
- 各カラムに20%エタノールの2mLを加え、真空ポンプを使用してこれを実行します。その後、20%エタノールの別の2mLを列に加え、新鮮な薄いプラスチックスターラーを使用して20%エタノールとビーズを混ぜ合わせ、4°Cで貯蔵するために50mLチューブに移します。 列を清掃し、水が各列を通って自由に流れるかどうかを確認し、すべてをきれいにし、後で使用するために片付けます。
注: 一部の列では、最終的にフィルターがブロックされ、実行速度が遅くなりすぎる、これらの列を置き換える、またはフィルターをクリーンアップする必要があります。そのため、樹脂を取り除き、カラムに水を充填して、フィルターが素早く流れるかどうかを確認して、定期的にフィルタをテストすることをお勧めします。フィルターは、変性溶出バッファーで満たされた閉じたカラムを残し、一晩振ることによって洗浄することができます。
2. イオン交換 - 単一タンパク質精製
- バッファの準備
注: すべてのバッファの詳細については 、表 1 を参照してください。- 2 L 低塩バッファーを準備します: 10 mM トリス pH 8.1 (5 mM トリス酸、5 mM トリスベース)。0.22 μmフィルターを使用したフィルターソリューション。
- 0.5 Lの高塩バッファーを準備します: 10 mM トリス pH 8.1, 4 M NaCl.NaClの116.9 gを測定し、上から10 mM TrisのpH 8.1で0.5 Lまでを作る。0.22 μmフィルターを使用したフィルターソリューション。
- 塩濃度シリーズを作る:0-1 M NaCl。
注:塩濃度の範囲は、すべてのタンパク質に対して調整することができます。- ラックに24 x 50 mLのラベル付き遠心チューブを設置
- 上記のバッファを使用して、0~1000 μMの範囲の24 x 14 mL NaCl希釈液を準備します。これはタンパク質に応じて25 mMまたは50 mMの増分で行うことができる。
- 次に、各チューブに10 mM Trisの必要なボリュームを追加します。各チューブを数回反転して混合します。
- サンプルの準備
- イオン交換により精製するサンプルを入手する。必要に応じて、後で分析するために50 μLのアリコートを取ります。
注: サンプルは常に冷たく保つ必要があります。これらは、ライセート、またはポストNi-NTAである可能性があります。変性バッファー内の Ni-NTA からのサンプルは、10 mM Tris バッファーでの透析またはバッファー交換が必要です。ネイティブバッファー内の Ni-NTA のサンプルを 10 mM Tris バッファーで希釈して塩濃度を下げ、タンパク質が IEX 樹脂に結合できるようにします。 - 18,000 x gで10分間スピンサンプル。
- 慎重に重さボートに上清を注ぎます。ペレットを邪魔しないようにしてください。
- 上清を20 mLのシリンジに入れ、0.22 μmのフィルターを取り付けます。
- フィルターを通して上澄みを新しい50 mLチューブにゆっくりと排出します。
- 希釈が必要な場合は、上清を上述した10mM Trisバッファーで希釈する(本実験では上清を2分1個希釈した)。その間に4°Cで保管してください。
- イオン交換により精製するサンプルを入手する。必要に応じて、後で分析するために50 μLのアリコートを取ります。
- 真空浄化のセットアップと平衡設定の準備
注: このプロトコルでは、1 つのサンプルの IEX 浄化に 1 つの列のみが使用されます。複数の精製については、次のセクションを参照してください。- 希望の樹脂の種類と容積を決定します。部分的に純粋なHisタグ付きSH3ドメインの最大20mgの経験則として、カラムあたり0.4mLのQ-セファローズ高速流動樹脂を使用してください(ステップ2.4.8参照)。
- 24 個の空の列 (下部にフィルターなし空) を組み込んだ MCPA に挿入します。柱は穿刺されたシーリングマットの穴にぴったりと収まるべきである。
- 精製が開始される最初の位置を除くすべての空の列に10 mLのシリンジプランジャーを置きます。
- 開いた柱の底部(フィルター付き)を5 mLシリンジプランジャーゴムガスケット(ピアス)を通して、柱の端にゴムリングを形成します。このゴム製リングは、この列が上の各空の列に挿入されたときに良好なシールを保証します。ここでは、MCPA の最初の空の列にこの列を挿入します。
- 開いたコレクションプレートを取り、真空マニホールドのベースにこのプレートを入れ、マニホールドの上部で閉じます。
- 組み立てたMCPA(コラム付き)を真空マニホールドの上に置きます。
- 真空ポンプシステムのチューブを真空の底部の入口/ノズルに取り付けます。
- 青いピペットチップ~2cmを下から切り、Q-セファロースビーズ(または他のイオン交換樹脂)を800μLまでとり、50/50ビーズエタノール溶液を混合して重ねないようにします。ピペット800 μLは、最初の位置にある1つのオープンカラム(フィルタ付き)に入り、ビーズがカラムの底に落ち着くと、20%エタノールを通り抜けるのに十分な真空のスイッチを入れます。
- セファロースビーズを含む柱を2 x 2 mLの10 mMトリスで洗います。トリスバッファが通る直前に真空をオフにして、樹脂が乾燥するのを防ぎます。ランオフは破棄できます。
注:樹脂が以前に使用されていた場合は、ステップ2.4.9の前に4 M NaClの5樹脂容量と10 mM Trisの5つの樹脂容積で洗浄することによって再生します。
- ローディング、洗浄、溶出
- 精製するすべてのサンプル(セクション3を参照)を第1位置のQセファローズカラムに移し、小さなプラスチックループを使用してサンプルとビーズを約2分間攪拌してから真空ポンプを切り替えます。
注: 余分な上清(>12 mL)の場合は、列を過剰に充填する際に注意してください。サンプルを実行し、もう一度実行する前に混合して、さらに追加してみましょう。 - 後で解析するためにフロースルーを保存/フリーズします。
- 別の開いたコレクションプレートを真空マニホールドに入れ、各セファローズカラムを10 mM Trisの2 x 2 mLで洗浄して保管します。
- 96 ウェルコレクションプレートを挿入し、A1 が左上隅に表示されるようにします。
- 最初の溶出分を集めるには、次の列からシリンジプランジャを取り外し、Qセファローズ列をこの位置に移動させ、シリンジプランジャーを前の位置に置きます。次いで、第1塩濃度のピペット1mLをQセファローズカラムに入した。ポンプの電源を入れ、溶出を収集します。ビーズの乾燥を避けるためにビーズの近くの液体ラインと同じようにポンプをオフにします。
- 次の溶出分を集めるには、次の列からシリンジプランジャを取り外し、Qセファローズ列をこの位置に移動して、シリンジプランジャを前の位置に置きます。
- 次の塩濃度の1 mLをカラムに加え、全ての濃度が使用され、24個の溶出が24個の別々のウェルに集まるまで、このプロセスを繰り返します。液体が隣接する井戸に入っていないか確認してください。
- 4 M NaCl 10 mM トリスの2 mLでカラムを洗います。これを実行してみましょう。
- 2mLの20%エタノールで洗浄してください。エタノールはビーズのすぐ上になるまで実行させ、保管用のシールカラムを使用します。
- 96ウェルコレクションプレートを保存し、UV分光法とSDSページで分析します。
- 精製するすべてのサンプル(セクション3を参照)を第1位置のQセファローズカラムに移し、小さなプラスチックループを使用してサンプルとビーズを約2分間攪拌してから真空ポンプを切り替えます。
3. イオン交換 - 24種類のタンパク質の同時精製
メモ:バッファー、一連の塩濃度、サンプルの準備の詳細については、ステップ2.1-2.3を参照してください。
- 浄化のセットアップの準備
注:精製システムの設定方法は、精製されるタンパク質の数と使用される塩条件の数によって大きく異なります。最大24サンプルまで12個のサンプルを同時に精製するには、溶出に使用される塩濃度ごとに回収プレートが必要です。12未満のサンプルについては、収集プレートを変更する前に、クロマトグラフィーカラムを同じMCPA内のいくつかの位置に移動させることが可能です。この場合、空の列に列を配置する必要はなく、MCPA シールマットに直接接続することができます。以下のプロトコルは、24の同時イオン交換精製用です。- 組み立てたMCPAを、開いた回収プレートを含む真空マニホールドの上にフィルターを付けた24個の空のカラムに直接取り付け、上記の単一の精製方法のように24個のイオン交換カラムを準備して洗浄します。この精製のために、エペンドルフリピータまたはシリンジを使用してピペットを迅速にカラムに入れるのが便利です。
- ローディング、洗浄、溶出
- 48ウェル回収プレートを真空マニホールドのベースに入れ、MCPAを取り付けます(洗浄された精製カラムを取り付けた状態)。A1 が左上隅にあることを確認します。
- 各タンパク質サンプル(一度に最大5 mL)を対応するカラムにピペットします。薄いプラスチックループ(汚染を避けるために各列に1つのループ)を使用して、各カラムを約2分間攪拌します。その後、真空ポンプのスイッチを入れ、上清を通します。
注: 余分な上清の場合は、列を過剰に充填するに注意してください。サンプルがその列を実行し、もう一度実行する前にミキシングを追加します。 - これは、すべてのタンパク質のフロースルーが含まれているので、後で分析するために48ウェルコレクションプレートを保存/凍結します。
- 真空マニホールドに別の48ウェルコレクションプレートを置き、各セファローズカラムを2 x 2 mLの10 mM Trisで洗います。
- マニホールドに最初の96ウェルコレクションプレートを挿入し、A1が左上隅に位置し、最初の塩濃度のピペット1mLが各列にピペットを入れ、真空ポンプをオンにしてカラムを通してこれを実行します。回収プレートを取り外し、パラフィルムで覆い、4°Cで保管して分析します。
- 溶出に使用される連続した塩濃度ごとにステップを繰り返します。すべての溶出に新しいコレクションプレートが使用され、各コレクションプレートにラベルが付いて保存されていることを確認します。
- 各カラムを10 mMトリス、4M NaClで洗浄します。
- 20%エタノールの2mLで各カラムを洗浄します。エタノールはビーズのすぐ上になるまで実行させ、保管用のシールカラムを使用します。
- 96ウェルコレクションプレートを保存し、UV分光法とSDS-PAGEで分析します。
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Representative Results
一例として、MCPAはNi-NTAを介して変性条件で14 AbpSH3変異体を精製することに成功した(図2A)。小さな汚染物質~25kDaが見られますが、タンパク質はまだ大部分が純粋です。この汚染物質は、大腸菌11に見られる一般的な共精製タンパク質であるYodAであると考えられている。図2Bは、天然条件下における11種類のSH3ドメインの精製を示す。変性条件で見られる小さな汚染物質は、ネイティブ条件で除去されます。これは、表1に示すように、MCPAがネイティブまたは変性バッファで構成される精製の比較に使用できることを示しています。
IEX MCPAを介したライセートの精製のための代表的なデータを 図3に示す。これは、AbpSH3が後で425 mMから700 mMの間で溶出するので、汚染物質の大部分から分離できることを示唆しています。カラムからタンパク質を溶出するのに必要な塩の濃度は、タンパク質と樹脂の静電相互作用の強さに関連する。細菌タンパク質の大部分は低いピを有する。しかし、関心のあるタンパク質は非常に陰性であり、pIが低いように見える。かなり純粋なAbpSH3タンパク質の良好な収率は、〜5kDaでのバンドとして見られるいくつかの様々な高分子量汚染物質AbpSH3で回収された。したがって、MCPAを介したIEXは、現在の汚染物質から十分な量のタンパク質をリセート中に分離することができるため、精製プロトコルの第一歩として使用することができます。
MCPA を使用した IEX によるさらなる精製は、Ni-NTA MCPA ランから溶出した分数に対して実証されています (図 4)。顕著に、2つの主要なピークは、このタンパク質のN末端切り捨てられたバージョンを分離することに対応することができる400および700 mM塩で最大で解決された。さらにDSFデータ解析を通じて、ピーク1はやや安定性が低く、ピーク2に対してわずかに低いTm を持っていたことが明らかになった。ライセートのIEX実行と比較して、全体の分数ははるかにきれいであり、IEXの前にNi-NTAステップを実行することの利点を示しています。より高い分子量のタンパク質にはわずかな汚染がありますが、画分はまだ大部分が純粋であり、NMRおよび熱/化学的変性アッセイを使用して良好な生物物理学的データを生み出しています。
図1: MCPA計測器の正面図 (A) 24 列が添付された MCPA 機器の正面図。列は96、48または開いたコレクションプレートに溶出を導くために96井戸のシールマットの中で均等に配置される。(B)シーリングマットの上部ビュー(C) 同じシーリングマットの下部ビュー. (D) 柱とシリンジプランジャーが取り付けられたMCPAの正面図。この図はドミンゲスら10から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:1x24カラム構成の一例を、変性及び在来条件下での種々のSH3変異体の精製を行う。(A)種々のAbpSH3変異体の変性精製。各車線を横切って〜25 kDaのわずかな汚染を発見することができます。(B) 11種類の酵母SH3ドメインの天然精製。汚染物質は各レーンから除去され、ゲルには見えなくなりました。この図はドミンゲスら10.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MCPAを介したIEXを用いたライセートの精製(A)イオン交換(IEX)からの全溶出の吸光度測定値をLVisプレート(BMG)で測定した。測定値は溶出の対応するNaCl濃度に対してプロットされる。最も高いタンパク質濃度のピークは、700 mM NaClで見られます。(B) で提示される IEX 塩溶出の SDS-PAGE 分析 (A)分子量マーカーは、ゲルの左側に示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MCPAシステムを介したIEXを用いたVJM2プール(ポストNi-NTA)の精製
(A)イオン交換(IEX)から採取した溶出の吸光度測定値をNanoDropを用いて測定した。測定値は溶出の対応するNaCl濃度に対してプロットされる。(B) で提示される IEX 塩溶出の SDS-PAGE 分析 (A)分子量マーカーは、ゲルの左側に示されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 変性バッファーの組成 | ネイティブ バッファの構成 | |
| リシスバッファー | 10 mM NaH2PO4、10mMトリス、6 M GuHCl、10 mMイミダゾール、pH 8.0 | 20 mM トリス、300 mM NaCl、10 mM イミダゾール、pH 8.0 |
| 洗浄バッファー | 10 mM NaH2PO4、10mMトリス、6 M GuHCl、20 mMイミダゾール、pH 8.0 | 20 mM トリス、300 mM NaCl、20 mM イミダゾール、pH 8.0 |
| 溶出バッファー | 10 mM NaH2PO4、10mMトリス、6 M GuHCl、0.2 M酢酸、pH 3.0 | 20 mM トリス、300 mM NaCl、250 mM イミダゾール、pH 8.0 |
| バッファ構成 | ||
| 高塩 | 5 mM トリス酸、5 mM トリスベース、pH 8.1、4 M NaCl | |
| 低塩 | 5 mM トリス酸、5 mMトリスベース、pH 8.1 |
表1:緩衝液の組成、ニNTA変性精製および天然精製およびイオン交換低塩及び高塩バッファー。
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Discussion
この方法は、比較的経験の浅いタンパク質生化学者に対して堅牢で使いやすいものですが、留意すべき考慮事項がいくつかあります。
コレクション プレートの過剰充填に関する注意
48ウェルコレクションプレート自体はウェルあたり5mLしか保持しませんが、各96ウェルは2mLしか保持しません。これは、井戸を過剰充填するリスクがあるので、列を通してバッファと実行サンプルを追加するときに注意する必要があります。特に、より大きなサンプルを精製のためにクロマトグラフィーカラムに移す際には注意が必要です。余分な上清がある場合は、部分で分割し、列を埋めるのに十分であり、次の部分を追加する前に実行してサンプルの過剰充填や損失を防ぐ必要があります。上清の各添加後、カラムは、ポンプをオンにする前に、ビーズにタンパク質結合の可能性を高めるために、小さなプラスチックループと混合する必要があります。プレートの向きとウェルの内容を追跡するには、精製を開始する前に、ラベル付きコーナー'A1'が常にプレートの左上隅にあることを確認してください。
溶出タンパク質
IEX とアフィニティーステップで溶出する場合、真空は最も低い設定で使用され、カラムを通して溶出バッファーを引き出します。これは、タンパク質濃度が高い場合は、タンパク質溶液が泡立ち、潜在的に変性につながる可能性がありますが、重力と比較して流量をスピードアップします。この場合、別の方法として、オープン列の上にシリンジ プランジャを使用して、バッファーを列にプッシュします。この場合、シリンジプランジャーは、液体を通して下のコレクションプレートに押し込むために、柱に穏やかに(強引ではない)押し込む必要があります。回収プレートを取り外す際には、MCPAに残った溶出液が近隣の井戸にこぼれず、汚染を引き起こさないように注意してください。
樹脂・カラムのメンテナンス
このプロトコルの重要なステップは、Ni樹脂とカラムの再生です。列は、精製プロトコルの開始または終了で再生成する必要があります。再生が終わりに発生する場合、樹脂は4°Cで20%エタノールに保存する必要があります。 クロマトグラフィーカラムフィルタが「ブロック」され、サンプルが必要以上に遅い速度でカラムを流れる可能性があります。この場合、一晩変性バッファーに浸し、水ですすいでカラムを交換するか、フィルターを取り除いて洗浄する必要があります。
ステップ3で示したように、MCPA装置の多様性は、単一のサンプルと同様に効果的に複数のタンパク質の精製のために利用することができる。イオン交換プロトコルは、異なるサンプルの数と使用されている塩濃度の数に適応し、実験のニーズに合わせて調整することができます。例えば、12個未満のサンプルが同時に精製される場合、同じプレート内の各溶出後にカラムを移動させたり、各溶出に対して回収プレートを交換したりする任意の組み合わせが必要です。例えば、4つのタンパク質のみが並行して精製されていた場合、カラムを1つのコレクションプレートを横切って移動して、プレートを交換する前に最大4塩濃度の溶出を収集することができます。MCPAは、種々の樹脂を用いて精製することができる−親和性およびイオン交換は既に議論されているが、疎水性相互作用クロマトグラフィーも可能であり、免疫親和クロマトグラフィー12にはさらに可能性がある。この方法は複数の小規模精製に焦点を当てていますが、MCPAは、サンプルポンプや高価なFPLCを必要とせずに、細菌培養の数リットルから精製するための単一の大きなクロマトグラフィーカラムに使用することができます。
説明したように、MCPA を使用してハイスループットイオン交換を行うには、複数の 24 個までの個別の収集プレートが必要です。これは実用的で、標準的な実験室のベンチトップに多くのスペースを必要とし、人為的ミスのリスクを高めます。さらに、24種類のサンプルからの溶出のタンパク質吸光度を測定することは困難である可能性があります。このような状況では、マルチチャンネルピペットは有益であり、複数のサンプルの転送をより迅速かつ容易にします。少量の場合、16マイクロドロップを含むLVisプレート(BMG)を使用して、ブラッドフォードアッセイ試薬などの他の試薬を使用する必要なく、濃度を直接測定することを検討してください。
真空ポンプの使用は、単に重力10を使用して達成されるものよりも3倍の速い浄化速度を可能にするが、樹脂の完全性を損なうことなく、それはいくつかの他の問題を作成する。精製中に真空の強度を維持するために、例えば、樹脂を詰めたカラムを挿入する前に取り出す必要がある10 mLのシリンジプランジャーでブロックされるすべてのカラムが必要です。プランジャーを1つずつ取り出すことはタイムリーなプロセスであり、真空の抵抗はカラムから取り除くのを困難にする可能性があります。
MCPAを用いた複数タンパク質IEX精製の詳細は、プロトコルに与えられている。この高スループット法は、時間効率が良く、制御可能であり、各精製のためのすべてのパラメータは、ユーザによって操作することができる。しかし、産業を含むほとんどのタンパク質生化学ラボでは、高速タンパク質液体クロマトグラフィーは、スループット、再現性、方法の転送と堅牢性の点で優れているタンパク質精製の好ましい方法です。タンパク質バイオソリューションによるタンパク質メーカーやAKTA FPLC生体分子精製システムなど、これらのシステムは、大きな成功を収めて浄化のボトルネック問題を緩和することができます。これらのシステムは優れた結果を得ているにもかかわらず、MCPAシステムを使用して見られる分離は、依然として高純度タンパク質を得るのに十分です。興味深いことに、私たちの研究室ではAKTA Start FPLCを使用してイオン交換クロマトグラフィーを行い、この機械で可能な線形勾配で解像度が高くなるかもしれませんが、複数のサンプルを実行するのに時間がかかり、このシステムで経験の浅い学生を訓練することははるかに困難です。
他の著しく安価なプレートベースの精製の選択肢が存在する。例えば、GEヘルスケアライフサイエンス(現Cytiva)とシグマ・アルドリッチは、特定の精製樹脂を備えた96個のウェルフィルタープレートとカートリッジを事前に包装しています。これらのフィルタープレートは、小規模なハイスループット精製を提供しますが、マイクログラムの収率範囲でのみ精製します。さらに、QIAGENのQIAvac 24 Plusは真空下でスピンカラムを使用しますが、流れやワッシュを収集することは実用的ではありません。
MCPAの柔軟な設計は、MCPA法を使用して手動でカラムやプレートを移動させることで、標準的なFPLCシステムと比較して人為的ミスを増加させる可能性がありますが、並列タンパク質精製を可能にします。しかし、サンプルを手動で列にロードする方が、標準的なFPLCを使用してカラムにサンプルをロードするよりも、より広範なトレーニングが必要なバルブやポンプの切り替えが含まれるため、間違いが簡単に行われる可能性があります。タンパク質精製のための完全に自動化されたシステムは、精製に日常的に取り組んでいる業界や学術ラボの浄化グループのMCPAよりも適していることは明らかです。しかし、高価な機器や維持費を払う余裕がなく、広範なトレーニングを避けたい、またはたまにタンパク質浄化に取り組みたい小さな研究所のために、MCPAは依然として良好な分離を得て、安価でセットアップしやすい効果的な代替システムを提供します。
MCPAは、複数のカラムを同時に並列精製してミリグラム量のタンパク質を生成することを可能にする、シンプルで安価な計測器で構成されています。さらに、この手法により、個々のカラムのモジュール性が向上し、スループットが向上します。これはこの方法に特有のものであり、現在のプレートベースの精製キットでは実現できません。
タンパク質の精製は、タンパク質の研究と特性評価および治療薬の開発に不可欠なままです。NMRやタンパク質結晶学などの生物物理学的手法は、純粋なタンパク質のミリグラム量に依存しているため、現在の発現および精製システムは、この2、13、14を達成するためのコストと時間を改善するためにさらなる開発が必要である。前述のように、自動精製システムは非自動化方法に比べ多くの利点を有しますが、高価な計測器やトレーニングを必要とする小規模なラボではコストがかかりすぎます。MCPAはかなり安く、開始コストは$ 4510です。さらに、このMCPAは、広範なトレーニングや継続的なメンテナンスを必要とせず、問題が発生した場合、これらは簡単に解決することができます。Ni-NTAに使用される変性バッファーなどの腐食性バッファーは、適切に洗浄されない場合、浄化システムを腐食させる可能性があります。しかし、MCPAの柔軟な設計は、必要に応じて、迅速なクリーニング、修理、およびコンパートメントの変更を可能にします。結論として、MCPAは、より手頃な価格の自動化システムが確立されるまで、より小さな実験室のための効果的で高スループットのタンパク質精製を促進する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
本論文では、国立衛生研究所の国立総合医学研究所の助成番号P20GM103451とリバプール大学の内部研究助成金の機関開発賞(IDeA)によって報告された研究が報告されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201240-100 | |
| 5 mL/ well collection plate | Agilent technologies | 201238-100 | |
| 12 mL chromatography columns | Bio-Rad | 7311550 | |
| 96 well long drip plate | Agilent technologies | 200919-100 | Come with 0.25 um filters which are to be removed. |
| 96 well plate seal/mat | Agilent technologies | 201158-100 | Should be peirceable |
| His60 Ni Superflow Resin | Takara Bio | 635660 | |
| HiTrap Q HP anion exchange column | GE Healthcare (Cytiva) | 17115301 | |
| Lvis plate reader | BMG LABTECH | Compatible with FLUOstar Omega plate reader | |
| Male leur plugs | Cole-Parmer | EW-45503-70 | |
| PlatePrep 96 well Vacuum Manifold Starter kit | Sigma-Aldrich | 575650-U | |
| Reservoir collection plate | Agilent technologies | 201244-100 | |
| The Repeater Plus | Eppendorf | 2226020 | With 5 mL and 50 mL syringes |
| VACUSAFE vacuum | INTEGRA | 158 320 | The vacusafe vacuum has a vacuum range from 300 mBar to 600 mBar and a 4 L waste collection bottle |
References
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