Summary

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Reaktionen auf Geschmacksreize

Published: February 11, 2021
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Summary

Hier präsentieren wir, wie man das genikulierte Ganglion einer lebenden, betäubten Labormaus freilegt und wie man Kalziumbildgebung verwendet, um die Reaktionen von Ensembles dieser Neuronen auf Geschmacksreize zu messen, was mehrere Versuche mit verschiedenen Stimulanzien ermöglicht. Dies ermöglicht detaillierte Vergleiche, welche Neuronen auf welche Tastants reagieren.

Abstract

In den letzten zehn Jahren haben Fortschritte bei genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) eine Revolution in der funktionellen In-vivo-Bildgebung gefördert. Mit Kalzium als Proxy für neuronale Aktivität bieten diese Techniken eine Möglichkeit, die Reaktionen einzelner Zellen innerhalb großer neuronaler Ensembles auf eine Vielzahl von Reizen in Echtzeit zu überwachen. Wir und andere haben diese Techniken angewendet, um die Reaktionen einzelner genikulater Ganglienneuronen auf Geschmacksreize abbilden, die auf die Zungen lebender anästhesierierter Mäuse angewendet werden. Das geniculate Ganglion besteht aus den Zellkörpern von Gustatorneuronen, die die vordere Zunge und den Gaumen innervieren, sowie einigen somatosensorischen Neuronen, die die Pinna des Ohres innervieren. Die Abbildung der geschmacksbedingten Reaktionen einzelner genikulater Ganglienneuronen mit GCaMP hat wichtige Informationen über die Tuning-Profile dieser Neuronen bei Wildtyp-Mäusen sowie eine Möglichkeit zum Nachweis peripherer Geschmacksfehlverdrahtungsphänotypen bei genetisch manipulierten Mäusen geliefert. Hier demonstrieren wir den chirurgischen Eingriff zur Freilegen des geniculaten Ganglions, die GCaMP-Fluoreszenzbildaufnahme, erste Schritte zur Datenanalyse und die Fehlerbehebung. Diese Technik kann mit transgen kodiertem GCaMP oder mit AAV-vermittelter GCaMP-Expression verwendet und modifiziert werden, um bestimmte genetische Untergruppen von Interesse abbilden (d. H. Cre-vermittelte GCaMP-Expression). Insgesamt ist die In-vivo-Calcium-Bildgebung von geniculaten Ganglien-Neuronen eine leistungsstarke Technik zur Überwachung der Aktivität peripherer Gustator-Neuronen und liefert ergänzende Informationen zu traditionelleren Ganznerven-Chorda-Tympani-Aufnahmen oder Geschmacksverhaltenstests.

Introduction

Eine Schlüsselkomponente des peripheren Geschmackssystems von Säugetieren ist das geniculate Ganglion. Zusätzlich zu einigen somatosensorischen Neuronen, die die Pinna des Ohres innervieren, besteht das Genikulat aus den Zellkörpern von Gustatorneuronen, die die vordere Zunge und den Gaumen innervieren. Ähnlich wie andere periphere sensorische Neuronen sind die geniculaten Ganglienneuronen pseudo-unipolar mit einem langen Axon, das peripher auf die Geschmacksknospen und zentral auf den Hirnstammkern des Solitärtraktsprojiziert 1. Diese Neuronen werden in erster Linie durch die Freisetzung von ATP durch Geschmacksrezeptorzellen aktiviert, die auf Geschmacksreize in der Mundhöhle reagieren2,3. ATP ist ein essentieller Neurotransmitter für die Geschmackssignalisierung, und P2rx-Rezeptoren, die von den gustatorischen Ganglienneuronen exprimiert werden, sind für ihre Aktivierung notwendig4. Angesichts der Tatsache, dass Geschmacksrezeptorzellen spezifische Geschmacksrezeptoren für eine bestimmte Geschmacksmodalität (süß, bitter, salzig, Umami oder sauer) exprimieren, wurde die Hypothese aufgestellt, dass gustatorische Ganglienneuronreaktionen auf Geschmacksreize ebenfalls eng abgestimmt wären5.

Ganze Nervenaufnahmen haben gezeigt, dass sowohl die Chorda-Tympani als auch die größeren oberen Petrosalnerven Gustatoriken leiten, die alle fünf Geschmacksmodalitäten zum geniculaten Ganglion6,7darstellen. Dies ließ jedoch immer noch Fragen über die Spezifität neuronaler Reaktionen auf ein bestimmtes Tastant offen: wenn es geschmacksmodalitätsspezifische Neuronen, polymodale Neuronen oder eine Mischung aus beidem gibt. Einzelfaseraufzeichnungen geben mehr Informationen über die Aktivität einzelner Fasern und ihre chemischenEmpfindlichkeiten 8,9,10, aber diese Methodik beschränkt sich auf die Erfassung von Daten aus einer kleinen Anzahl von Fasern. In ähnlicher Weise geben elektrophysiologische In-vivo-Aufzeichnungen einzelner Genikulat-Ganglienneuronen von Ratten Aufschluss über die Reaktionen einzelner Neuronen11,12,13, verlieren aber immer noch die Aktivität der Population und liefern relativ wenige Neuronenaufnahmen pro Tier. Um die Reaktionsmuster neuronaler Ensembles zu analysieren, ohne die Aktivität einzelner Neuronen aus den Augen zu verlieren, mussten neue Techniken eingesetzt werden.

Die Calcium-Bildgebung, insbesondere unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren wie GCaMP, hat diesen technischen Durchbruch gebracht14,15,16,17,18. GCaMP verwendet Kalzium als Proxy für neuronale Aktivität und erhöht die grüne Fluoreszenz, wenn der Kalziumspiegel in der Zelle ansteigt. Neue Formen von GCaMP werden weiterhin entwickelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, die Bindungskinetik anzupassen und sich für spezialisierte Experimente anzupassen19. GCaMP bietet im Gegensatz zur Aufzeichnung ganzer Nerven eine Auflösung einzelner Neuronen und kann im Gegensatz zur Einzelfaser- oder Einzelzellaufzeichnung gleichzeitig die Reaktionen von Ensembles von Neuronen messen. Die Calcium-Bildgebung der Genikulatganglien hat bereits wichtige Informationen über die Tuning-Profile dieser Neuronen bei Wildtyp-Mäusen16,20geliefert und periphere Geschmacksfehlverdrahtungsphänotypen bei genetisch manipulierten Mäusen identifiziert18.

Eine große Schwierigkeit bei der Anwendung von In-vivo-Calcium-Bildgebungstechniken auf das geniculate Ganglion besteht darin, dass es in der knöchernen Paukenbulle eingekapselt ist. Um einen optischen Zugang zum Genikulat zu erhalten, ist eine heikle Operation erforderlich, um die Knochenschichten zu entfernen und gleichzeitig das Ganglion intakt zu halten. Zu diesem Zweck haben wir diesen Leitfaden erstellt, um anderen Forschern den Zugang zum geniculaten Ganglion zu helfen und die GCaMP-vermittelten fluoreszierenden Reaktionen dieser Neuronen abbilden, um Reize in vivo zu schmecken.

Protocol

Tierprotokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der University of Texas San Antonio überprüft und genehmigt. 1. Präoperative Einrichtung HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass die Ersteinrichtung der Ausrüstung hier nicht behandelt wird, da sie je nach Verwendeten Pumpensystem, Mikroskop, Kamera und Bildgebungssoftware variiert. Anweisungen zur Einrichtung finden Sie in den Anleitungsmaterialien des Geräteherstellers. Für die von den Autore…

Representative Results

Nach dem Protokoll wurde ein transgenes Snap25-GCaMP6s-Tier sediert, genulierte Ganglien wurden freigelegt und Tastant wurde während der Videoaufnahme auf die Zunge aufgetragen. Ziel des Experiments war es zu definieren, welche Tastants Reaktionen aus jeder Zelle hervorrief. Tastantien (30 mM AceK, 5 mM Chinin, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Zitronensäure)18 wurden in DI-Wasser gelöst und 2 s getrennt durch 13 s DI-Wasser auf die Zunge aufgetragen. <p class="jove_content" fo:keep-t…

Discussion

Diese Arbeit beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, um das geniculate Ganglion chirurgisch freizulegen und die Aktivität seiner Neuronen mit GCaMP6s visuell aufzuzeichnen. Dieses Verfahren ist dem zuvor beschriebenen17sehr ähnlich, mit einigen bemerkenswerten Ausnahmen. Erstens ermöglicht die Verwendung eines Kopfpfostens eine einfache Anpassung der Kopfpositionierung während der Operation. Zweitens, in Bezug auf die Stimulusabgabe, fließt der Ansatz von Wu und Dvoryanchikov Geschmack…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken S. Humayun für die Maushaltung. Die Finanzierung dieser Arbeit wurde teilweise durch den Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) und NIH-SC2-GM130411 der UTSA an L.J.M bereitgestellt.

Materials

1 x #5 Inox Forceps Fine Science Tools NC9792102
1ml Syringe with luer lock Fisher Scientific 14-823-30
2 x #3 Inox Forceps Fine Science Tools M3S 11200-10
27 Gauge Blunt Dispensing Needle Fisher Scientific NC1372532
3M Vetbond Fisher Scientific NC0398332
4-40 Machine Screw Hex Nuts Fastenere 3SNMS004C
4-40 Socket Head Cap Screw Fastenere 3SSCS04C004
Absorbent Points Fisher Scientific 50-930-668
Acesulfame K Fisher Scientific A149025G
Artificial Tears Akorn 59399-162-35
BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle Fisher Scientific 14-829-6D
Blunt Retractors FST 18200-09
Breadboard Thor Labs MB8
Citric Acid Fisher Scientific A95-3
Cohan-Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-02
Contemporary Ortho-Jet Liquid Lang 1504
Contemporary Ortho-Jet Powder Lang 1520
Cotton Tipped Applicators Fisher 19-062-616
Custom Head Post Holder eMachineShop See attached file 202410.ems
Custom Metal Head Post eMachineShop See attached file 202406.ems
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted Hamamatsu C13440
Disection Scope Leica M80
Hair Clippers Kent Scientific CL7300-Kit
IMP Fisher Scientific AAJ6195906
Ketamine Ketaved NDC 50989-996-06
LED Cold Light Source Leica Mcrosystems KL300LED
Luer Lock 1/16" Tubing Adapters Fisher 01-000-116
Microscope Olympus BX51WI
Mini-series Optical Posts Thorlabs MS2R
MPG Fisher Scientific AAA1723230
MXC-2.5 Rotatable probe Clamp Siskiyou 14030000E
NaCl Fisher Scientific 50-947-346
petri dishes Fisher Scientific FB0875713A
Pressurized air Airgas AI Z300
Quinine Fisher Scientific AC163720050
Self Sticking Labeling Tape Fisher Scientific 159015R
Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) Automate Scientific 05-14
Sola SM Light Engine Lumencor
Snap25-2A-GCaMP6s-D JAX 025111
Student Fine Scissors Fine Science Tools 91460-11
Surgical Probe Roboz Surgical Store RS-6067
Surgical Probe Holder Roboz Surgical Store RS-6061
Thread Gütermann 02776
BD Intramedic Tubing Fisher Scientific 22-046941
Two Stage Gas Regulator Airgas Y12FM244B580-AG
Tygon vinyl tubing – 1/16" Automate Scientific 05-11
Valvelink8.2 digital/manual controller Automate Scientific 01-18
Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System Automate Scientific 17-pp-54
Xylazine Anased NADA# 139-236

References

  1. Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).
  2. Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
  3. Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
  4. Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
  5. Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
  6. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  7. Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. Gustatory neural response in the mouse. Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).
  8. Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
  9. Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
  10. Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
  11. Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).
  12. Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
  13. Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
  14. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  15. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
  16. Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
  17. Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
  18. Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Rewiring the taste system. Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).
  19. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  20. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
  21. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  22. . dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014)
  23. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  24. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
  25. Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
  26. Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
  27. Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).

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Cite This Article
Fowler, B. E., Macpherson, L. J. In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli. J. Vis. Exp. (168), e62172, doi:10.3791/62172 (2021).

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