Summary

In vivo Imagem de cálcio do rato Geniculado Gânglio Respostas ao Sabor Estímulo

Published: February 11, 2021
doi:

Summary

Aqui apresentamos como expor o gânglio geniculado de um rato de laboratório vivo, anestesiado e como usar imagens de cálcio para medir as respostas desses conjuntos desses neurônios a estímulos de sabor, permitindo múltiplos ensaios com diferentes estimulantes. Isso permite comparações profundas das quais os neurônios respondem a quais tastantes.

Abstract

Nos últimos dez anos, os avanços nos indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs) promoveram uma revolução na imagem funcional in vivo. Usando o cálcio como proxy para a atividade neuronal, essas técnicas fornecem uma maneira de monitorar as respostas de células individuais dentro de grandes conjuntos neuronais para uma variedade de estímulos em tempo real. Nós, e outros, aplicamos essas técnicas para visualizar as respostas dos neurônios de gânglios gênicos individuais para provar estímulos aplicados às línguas de camundongos anesthetizados vivos. O gânglio geniculado é composto pelos corpos celulares de neurônios gustativos que inervam a língua e o paladar anteriores, bem como alguns neurônios somatosensoriais que inervam o pinna da orelha. A imagem das respostas evocadas pelo sabor de neurônios de gânglios gênicos individuais com GCaMP forneceu informações importantes sobre os perfis de ajuste desses neurônios em camundongos do tipo selvagem, bem como uma maneira de detectar fenótipos de desocupação de gosto periférico em camundongos geneticamente manipulados. Aqui demonstramos o procedimento cirúrgico para expor o gânglio geniculado, aquisição de imagem de fluorescência GCaMP, etapas iniciais para análise de dados e solução de problemas. Esta técnica pode ser usada com GCaMP codificado transgenicamente, ou com expressão GCaMP mediada por AAV, e pode ser modificada para imagem de subconjuntos genéticos particulares de interesse (ou seja, expressão GCaMP mediada por Cre). No geral, a imagem in vivo de cálcio de neurônios de gânglios geniculados é uma técnica poderosa para monitorar a atividade de neurônios gustativos periféricos e fornece informações complementares para gravações mais tradicionais de chorda tympani de nervo inteiro ou ensaios de comportamento de paladar.

Introduction

Um componente-chave do sistema de gosto periférico dos mamíferos é o gânglio geniculado. Além de alguns neurônios somatossensoriais que inervam o pinna do ouvido, o geniculado é composto pelos corpos celulares de neurônios gustativos que inervam a língua anterior e o paladar. Semelhante a outros neurônios sensoriais periféricos, os neurônios de gânglios geniculados são pseudo-unipolares com um longo axônio projetando periféricamente para as papilas gustativas, e centralmente para o núcleo do tronco cerebral do trato solitário1. Esses neurônios são ativados principalmente pela liberação de ATP por células receptoras de paladar que respondem a estímulos de paladar na cavidade oral2,3. ATP é um neurotransmissor essencial para sinalização de paladar, e receptores P2rx expressos pelos neurônios de gânglio gustativo são necessários para sua ativação4. Dado que as células receptoras de sabor expressam receptores de sabor específicos para uma modalidade de sabor particular (doce, amargo, salgado, umami ou azedo), tem sido hipótese que as respostas do neurônio gânglio gustativo a estímulos de sabor também seriam estreitamente ajustadas5.

Gravações nervosas inteiras mostraram que tanto o chorda tympani quanto os nervos petrosais superiores maiores conduzem sinais gustativos representando todas as cinco modalidades de gosto ao gânglio geniculado6,7. No entanto, isso ainda deixou dúvidas sobre a especificidade das respostas neuronais a um determinado tastant: se houver a modalidade de sabor neurônios específicos, neurônios polimodais ou uma mistura de ambos. Registros únicos de fibras dão mais informações sobre a atividade de fibras individuais e suas sensibilidades químicas8,9,10, mas essa metodologia limita-se à coleta de dados de pequenos números de fibras. Da mesma forma, gravações eletrofisiológicas in vivo de neurônios gânglios gênicos individuais de ratos dão informações sobre as respostas dos neurônios individuais11,12,13, mas ainda perdem a atividade da população e produzem relativamente poucos registros de neurônios por animal. Para analisar os padrões de resposta dos conjuntos neuronais sem perder de vista a atividade dos neurônios individuais, novas técnicas precisavam ser empregadas.

A imagem de cálcio, especialmente utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificados como o GCaMP, proporcionou esse avanço técnico14,15,16,17,18. GCaMP usa cálcio como proxy para atividade neuronal, aumentando a fluorescência verde à medida que os níveis de cálcio dentro da célula aumentam. Novas formas de GCaMP continuam a ser desenvolvidas para melhorar a relação sinal/ruído, ajustar cinética de ligação e adaptar-se para experimentos especializados19. O GCaMP fornece resolução de neurônios únicos, ao contrário de todo o registro nervoso, e pode medir simultaneamente respostas de conjuntos de neurônios, ao contrário de uma única fibra ou gravação de célula única. A imagem de cálcio do gânglio geniculado já forneceu informações importantes sobre os perfis de ajuste desses neurônios em camundongos do tipo selvagem16,20, e identificou fenótipos de pericular de erro de giro em camundongos geneticamente manipulados18.

Uma grande dificuldade para aplicar técnicas de imagem de cálcio in vivo ao gânglio geniculado é que ele é encapsulado dentro da bula tympanica óssea. Para obter acesso óptico ao geniculado, uma cirurgia delicada é necessária para remover as camadas dos ossos, mantendo o gânglio intacto. Para isso, criamos este guia para ajudar outros pesquisadores a acessar o gânglio geniculado e a imagem que o GCaMP mediava respostas fluorescentes desses neurônios para provar estímulos in vivo.

Protocol

Os protocolos animais foram revisados e aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Texas San Antonio. 1. Configuração pré-operatória NOTA: Observe que a configuração inicial do equipamento não é tratada aqui, pois ela irá variar de acordo com o sistema de bomba, microscópio, câmera e software de imagem usados. Para obter instruções de configuração, consulte os materiais instrucionais fornecidos pelo fornecedo…

Representative Results

Seguindo o protocolo, um animal Snap25-GCaMP6s transgênico foi sedado, gânglios geniculados foram expostos, e tastant foi aplicado na língua enquanto o vídeo era gravado. O objetivo do experimento era definir quais tastantes provocavam respostas de cada célula. Tastants (AceK de 30 mM, 5 mM Quinine, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 mM Ácido Cítrico)18 foram dissolvidos em água DI e foram aplicados na língua por 2 s separados por 13 s de água DI. <p class="jove_content" fo:keep-to…

Discussion

Este trabalho descreve um protocolo passo-a-passo para expor cirurgicamente o gânglio geniculado e registrar visualmente a atividade de seus neurônios com GCaMP6s. Este procedimento é muito semelhante ao descrito anteriormente17, com algumas exceções notáveis. Primeiro, o uso de um poste na cabeça permite um ajuste fácil do posicionamento da cabeça durante a cirurgia. Em segundo lugar, em relação à entrega de estímulos, a abordagem de Wu e Dvoryanchikov flui estímulos de sabor atrav?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a S. Humayun pela criação de ratos. O financiamento para este trabalho foi fornecido em parte pelo Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) e nih-SC2-GM130411 para L.J.M.

Materials

1 x #5 Inox Forceps Fine Science Tools NC9792102
1ml Syringe with luer lock Fisher Scientific 14-823-30
2 x #3 Inox Forceps Fine Science Tools M3S 11200-10
27 Gauge Blunt Dispensing Needle Fisher Scientific NC1372532
3M Vetbond Fisher Scientific NC0398332
4-40 Machine Screw Hex Nuts Fastenere 3SNMS004C
4-40 Socket Head Cap Screw Fastenere 3SSCS04C004
Absorbent Points Fisher Scientific 50-930-668
Acesulfame K Fisher Scientific A149025G
Artificial Tears Akorn 59399-162-35
BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle Fisher Scientific 14-829-6D
Blunt Retractors FST 18200-09
Breadboard Thor Labs MB8
Citric Acid Fisher Scientific A95-3
Cohan-Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-02
Contemporary Ortho-Jet Liquid Lang 1504
Contemporary Ortho-Jet Powder Lang 1520
Cotton Tipped Applicators Fisher 19-062-616
Custom Head Post Holder eMachineShop See attached file 202410.ems
Custom Metal Head Post eMachineShop See attached file 202406.ems
DC Temperature Controller FHC 40-90-8D
Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted Hamamatsu C13440
Disection Scope Leica M80
Hair Clippers Kent Scientific CL7300-Kit
IMP Fisher Scientific AAJ6195906
Ketamine Ketaved NDC 50989-996-06
LED Cold Light Source Leica Mcrosystems KL300LED
Luer Lock 1/16" Tubing Adapters Fisher 01-000-116
Microscope Olympus BX51WI
Mini-series Optical Posts Thorlabs MS2R
MPG Fisher Scientific AAA1723230
MXC-2.5 Rotatable probe Clamp Siskiyou 14030000E
NaCl Fisher Scientific 50-947-346
petri dishes Fisher Scientific FB0875713A
Pressurized air Airgas AI Z300
Quinine Fisher Scientific AC163720050
Self Sticking Labeling Tape Fisher Scientific 159015R
Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) Automate Scientific 05-14
Sola SM Light Engine Lumencor
Snap25-2A-GCaMP6s-D JAX 025111
Student Fine Scissors Fine Science Tools 91460-11
Surgical Probe Roboz Surgical Store RS-6067
Surgical Probe Holder Roboz Surgical Store RS-6061
Thread Gütermann 02776
BD Intramedic Tubing Fisher Scientific 22-046941
Two Stage Gas Regulator Airgas Y12FM244B580-AG
Tygon vinyl tubing – 1/16" Automate Scientific 05-11
Valvelink8.2 digital/manual controller Automate Scientific 01-18
Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System Automate Scientific 17-pp-54
Xylazine Anased NADA# 139-236

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Cite This Article
Fowler, B. E., Macpherson, L. J. In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli. J. Vis. Exp. (168), e62172, doi:10.3791/62172 (2021).

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