마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응
Summary
여기에서 우리는 살아있는, 마취 실험실 마우스의 조야성 신경절 신경절을 드러내는 방법과 각성제를 맛보기 위하여 이 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위하여 칼슘 화상 진찰을 사용하는 방법을 제시합니다, 다른 각성제를 가진 다중 예심을 허용하. 이것은 어떤 신경 세포가 어떤 tastants에 반응하는지의 깊이 비교를 허용합니다.
Abstract
지난 10 년 이내에, 유전자 로 코딩 된 칼슘 지표 (GECIs)의 발전은 생체 기능 적 이미징의 혁명을 촉진했습니다. 신경 활동에 대 한 프록시로 칼슘을 사용 하 여, 이러한 기술은 실시간으로 자극의 다양 한 큰 신경 앙상블 내에서 개별 세포의 응답을 모니터링 하는 방법을 제공. 우리 등은 이러한 기술을 적용하여 개별 조니컬트 신경절 뉴런의 반응을 이미지화하여 살아있는 마취 마우스의 혀에 적용되는 자극을 맛볼 수 있습니다. 조닐레이트 신경절은 전방 혀와 입맛을 내면에 가두는 구형 뉴런의 세포 체와 귀의 정강을 가두는 일부 세포 감각 뉴런으로 구성됩니다. GCaMP를 사용하여 개별 조개 신경절 신경전 뉴런의 맛에 자극된 반응을 이미징하는 것은 야생 형 마우스에서 이러한 뉴런의 튜닝 프로파일뿐만 아니라 유전적으로 조작 된 마우스의 표현형을 잘못 배선하는 말초 맛을 감지하는 방법에 대한 중요한 정보를 제공했습니다. 여기서 는 조폐성 신경절, GCaMP 형광 이미지 수집, 데이터 분석을 위한 초기 단계 및 문제 해결을 노출시키는 외과 적 절차를 시연합니다. 이 기술은 형질적으로 인코딩된 GCaMP 또는 AAV 매개 GCaMP 발현과 함께 사용될 수 있으며, 특정 유전 적 관심 하위 집합(즉, Cre-mediated GCaMP 발현)을 이미지하도록 수정할 수 있다. 전반적으로, 조폐성 신경절 신경의 생체 내 칼슘 이미징은 말초 구형 뉴런의 활동을 모니터링하기위한 강력한 기술이며 전통적인 전신경 코르다 tympani 녹음 또는 맛 행동 분석에 보완 적인 정보를 제공합니다.
Introduction
포유류 말초 맛 시스템의 핵심 성분은 조질성 신경절입니다. 귀의 정점을 내면으로 만드는 일부 소마토 감각 뉴런 외에도, 조닐은 전방 혀와 입맛을 내면에 가두는 구형 뉴런의 세포 체로 구성됩니다. 다른 말초 감각 뉴런과 유사하게, 조폐성 신경절 뉴런은 미각에 말초로 투사되는 긴 축삭을 가진 의사 단극성이며, 고독한1의뇌줄기 핵에 중앙으로 투사된다. 이러한 뉴런은 주로 구강2,3에서맛 자극에 반응하는 맛 수용체 세포에 의해 ATP의 방출에 의해 활성화된다. ATP는 맛 신호에 필수적인 신경 전달 물질이며, 구술 신경절 뉴런에 의해 발현된P2rx 수용체는 활성화4에 필요하다. 맛 수용체 세포가 특정 맛 양식 (달콤한, 쓴 맛, 짠, 감칠맛 또는 신맛)에 대한 특정 맛 수용체를 표현하는 것을 감안할 때, 맛 자극에 대한 구술 신경절 뉴런 반응도 좁게 조정 될 것이라고 가설되었습니다5.
전체 신경 기록은 코다 티파니와 더 큰 우수한 석유 신경이 조랑말 신경절6,7에모든 다섯 맛 양식체를 나타내는 돌풍 신호를 실시 모두 보여 주었다. 그러나, 이것은 여전히 주어진 술에 신경 응답의 특이성에 대 한 질문을 왼쪽: 맛 양식 특정 뉴런이 있는 경우, polymodal 뉴런, 또는 둘 다의 혼합물. 단일 섬유 레코딩은 개별 섬유의 활성과 화학적 민감도8,9,10에대한 자세한 정보를 제공하지만, 이 방법론은 소수의 섬유로부터 데이터를 수집하는 것으로 제한됩니다. 유사하게, 개별 쥐 의 생체 내 전기생리학적 기록에서 신경절 뉴런은 개별 뉴런11,12,13의반응에 대한 정보를 제공하지만, 여전히 인구의 활성을 잃고 동물당 상대적으로 적은 뉴런 기록을 산출한다. 개별 뉴런의 활성의 시력을 잃지 않고 신경 앙상블의 반응 패턴을 분석하기 위해 새로운 기술을 사용할 필요가 있습니다.
칼슘 이미징, 특히 GCaMP와 같은 유전자 로 인코딩 된 칼슘 지표를 사용하여이 기술적 돌파구를 제공했습니다14,15,16,17,18. GCaMP는 칼슘을 신경 활동의 대리자로 사용하여 세포 내의 칼슘 수준으로 녹색 형광을 증가시킵니다. 새로운 형태의 GCaMP는 신호 대 노이즈 비율을 개선하고, 결합 운동학을 조정하며, 특수실험(19)에적응하기 위해 지속적으로 개발되고 있다. GCaMP는 전체 신경 기록과 달리 단일 신경 해상도를 제공하며 단일 섬유 또는 단일 세포 기록과 달리 뉴런 앙상블의 반응을 동시에 측정할 수 있습니다. 조닐칼갱리아의 칼슘 이미징은 이미 야생형 마우스16,20에서이들 뉴런의 튜닝 프로파일에 대한 중요한 정보를 제공하고 있으며, 유전자 조작마우스(18)에서표현형을 잘못 배선하는 말초 맛을 확인하였다.
비보 칼슘 이미징 기술을 조닐레이트 신경절에 적용하는 한 가지 주요 어려움은 뼈 성 막판 불라 내에 캡슐화된다는 것입니다. 조폐제에 대한 광학 적 접근을 얻으려면 신경절을 그대로 유지하면서 뼈층을 제거하기 위해 섬세한 수술이 필요합니다. 그 목적을 위해, 우리는 그밖 연구원이 조닐레이트 신경절에 접근하고 생체 내 자극을 맛하기 위하여 이 뉴런의 GCaMP 중재형 반응을 심상에 접근하는 것을 돕기 위하여 이 가이드를 만들었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 작품은 조폐성 신경절을 외과적으로 노출하고 GCaMP6s로 뉴런의 활동을 시각적으로 기록하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 몇 가지 주목할 만한 예외를 제외하고 이전에 설명된17과매우 유사합니다. 첫째, 헤드 포스트를 사용하면 수술 중 헤드 포지셔닝을 쉽게 조정할 수 있습니다. 둘째, 자극 전달에 관해서는, 우와 드보리안치코프의 접근법은 식도?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 마우스 축산에 대한 S. 후마윤에게 감사드립니다. 이 작업에 대한 자금은 UTSA의 뇌 건강 컨소시엄 대학원 및 박사 후 종자 보조금 (B.E.F.) 및 NIH-SC2-GM130411에서 L.J.M부분적으로 제공되었습니다.
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
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