Imaging in vivo del calcio delle risposte del neurone ganglio genicolato di topo agli stimoli del gusto
Summary
Qui presentiamo come esporre il ganglio genicolato di un topo da laboratorio vivo e anestetizzato e come utilizzare l’imaging del calcio per misurare le risposte degli insiemi di questi neuroni agli stimoli del gusto, consentendo prove multiple con diversi stimolanti. Ciò consente confronti approfonditi di quali neuroni rispondono a quali tastants.
Abstract
Negli ultimi dieci anni, i progressi negli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) hanno promosso una rivoluzione nell’imaging funzionale in vivo. Utilizzando il calcio come proxy per l’attività neuronale, queste tecniche forniscono un modo per monitorare le risposte delle singole cellule all’interno di grandi insiemi neuronali a una varietà di stimoli in tempo reale. Noi, e altri, abbiamo applicato queste tecniche per immaginare le risposte dei singoli neuroni gangliali genicolati agli stimoli gustavi applicati alle lingue di topi vivi anestetizzati. Il ganglio genicolato è composto dai corpi cellulari dei neuroni gustativi che innervano la lingua e il palato anteriori e da alcuni neuroni somatosensoriali che innervano la pinna dell’orecchio. L’imaging delle risposte evocate dal gusto dei singoli neuroni gangliosi genicolati con GCaMP ha fornito importanti informazioni sui profili di sintonizzazione di questi neuroni nei topi wild-type e un modo per rilevare i fenotipi di errore di gusto periferico nei topi geneticamente manipolati. Qui dimostriamo la procedura chirurgica per esporre il ganglio genicolato, l’acquisizione dell’immagine di fluorescenza GCaMP, i passaggi iniziali per l’analisi dei dati e la risoluzione dei problemi. Questa tecnica può essere utilizzata con GCaMP codificato transgenicamente o con espressione GCaMP mediata da AAV e può essere modificata per l’immagine di particolari sottoinsiemi genetici di interesse (ad esempio, espressione GCaMP mediata da Cre). Nel complesso, l’imaging del calcio in vivo dei neuroni gangliari genicolati è una tecnica potente per monitorare l’attività dei neuroni gustativi periferici e fornisce informazioni complementari alle registrazioni più tradizionali della corda timpani a nervi interi o ai saggi del comportamento del gusto.
Introduction
Un componente chiave del sistema gustatico periferico dei mammiferi è il ganglio genicolato. Oltre ad alcuni neuroni somatosensoriali che innervano la pinna dell’orecchio, il genicolato è costituito dai corpi cellulari dei neuroni gustativi che innervano la lingua e il palato anteriori. Simile ad altri neuroni sensoriali periferici, i neuroni gangliogenici sono pseudo-unipolari con un lungo assone che si proietta perifericamente verso le papille gustative e centralmente verso il nucleo del tronco cerebrale del tratto solitario1. Questi neuroni sono attivati principalmente dal rilascio di ATP da parte delle cellule del recettore del gusto che rispondono agli stimoli del gusto nella cavità orale2,3. L’ATP è un neurotrasmettitore essenziale per la segnalazione del gusto e i recettori P2rx espressi dai neuroni gangliari gustativi sono necessari per la loro attivazione4. Dato che le cellule recettrici del gusto esprimono specifici recettori del gusto per una particolare modalità di gusto (dolce, amaro, salato, umami o acido), è stato ipotizzato che le risposte dei neuroni gangliari gustativi agli stimoli del gusto sarebbero anche strettamente sintonizzate5.
Intere registrazioni nervose hanno mostrato che sia la chorda timone che i nervi petrosali superiori maggiori conducono segnali gustativi che rappresentano tutte e cinque le modalità di gusto al ganglio genicolato6,7. Tuttavia, questo ha ancora lasciato domande sulla specificità delle risposte neuronali a un dato tastant: se ci sono neuroni specifici della modalità di gusto, neuroni polimodali o una miscela di entrambi. Le registrazioni a fibra singola forniscono maggiori informazioni sull’attività delle singole fibre e sulle loro sensibilità chimiche8,9,10,ma questa metodologia è limitata alla raccolta di dati da un piccolo numero di fibre. Allo stesso modo, le registrazioni elettrofisiologiche in vivo di singoli neuroni gangliali genicolati di ratto forniscono informazioni sulle risposte dei singoli neuroni11,12,13, ma perde ancora l’attività della popolazione e produce relativamente poche registrazioni neuronali per animale. Al fine di analizzare i modelli di risposta degli insiemi neuronali senza perdere di vista l’attività dei singoli neuroni, è stato necessario impiegare nuove tecniche.
L’imaging del calcio, in particolare utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati come GCaMP, ha fornito questa svolta tecnica14,15,16,17,18. GCaMP utilizza il calcio come proxy per l’attività neuronale, aumentando la fluorescenza verde all’aumentare dei livelli di calcio all’interno della cellula. Nuove forme di GCaMP continuano ad essere sviluppate per migliorare il rapporto segnale/rumore, regolare la cinetica di legame e adattarsi per esperimenti specializzati19. GCaMP fornisce una risoluzione a singolo neurone, a differenza della registrazione dell’intero nervo, e può misurare contemporaneamente le risposte di insiemi di neuroni, a differenza della registrazione a fibra singola o singola cellula. L’imaging del calcio dei gangli genicolati ha già fornito importanti informazioni sui profili di sintonizzazione di questi neuroni nei topi wild-type16,20e ha identificato fenotipi di miswiring del gusto periferico nei topi geneticamente manipolati18.
Una delle maggiori difficoltà nell’applicare tecniche di imaging del calcio in vivo al ganglio genicolato è che è incapsulato all’interno della bolla timpanica ossea. Per ottenere l’accesso ottico al genicolato, è necessario un delicato intervento chirurgico per rimuovere gli strati di ossa, mantenendo intatto il ganglio. A tal fine, abbiamo creato questa guida per aiutare altri ricercatori ad accedere al ganglio genicolato e immaginare le risposte fluorescenti mediate da GCaMP di questi neuroni per gustare gli stimoli in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro descrive un protocollo passo-passo per esporre chirurgicamente il ganglio genicolato e registrare visivamente l’attività dei suoi neuroni con GCaMP6s. Questa procedura è molto simile a quella descritta in precedenza17, con alcune eccezioni degne di nota. In primo luogo, l’uso di un palo della testa consente una facile regolazione del posizionamento della testa durante l’intervento chirurgico. In secondo luogo, per quanto riguarda la consegna dello stimolo, l’approccio di Wu e Dvory…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano S. Humayun per l’allevamento dei topi. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito in parte dal Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) dell’UTSA e dal NIH-SC2-GM130411 a L.J.M.
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
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