マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する
Summary
ここでは、生きた麻酔薬用マウスのジェニュー酸神経節を暴露する方法と、カルシウムイメージングを使用してこれらのニューロンのアンサンブルの応答を測定して刺激を味わう方法を紹介し、異なる覚醒剤を用いた複数の試験を可能にする。これにより、どのニューロンがどのタスタントに反応するかを深く比較することができます。
Abstract
過去10年以内に、遺伝子組み換えカルシウム指標(GEC)の進歩は、生体内機能イメージングにおける革命を促進しました。これらの技術は、神経活動の代理としてカルシウムを使用して、大規模なニューロンアンサンブル内の個々の細胞の反応をリアルタイムで様々な刺激に対して監視する方法を提供する。我々や他の人々は、これらの技術を適用して、個々の原発性神経節ニューロンの応答を画像化し、生きた麻酔マウスの舌に加わる刺激を味わってきた。原発性神経節は、舌前舌と口蓋を内在させる気味ニューロンの細胞体と、耳のピナを内在させる体性感覚ニューロンで構成される。GCaMPを用いた個々の原発性神経節ニューロンの味覚誘発応答をイメージングすることは、野生型マウスにおけるこれらのニューロンの調整プロファイルに関する重要な情報と、遺伝的に操作されたマウスにおける末梢の味の誤配線表現型を検出する方法を提供した。ここでは、原発性神経節、GCaMP蛍光画像取得、データ分析の初期ステップ、およびトラブルシューティングを行うための外科的手順を示す。この技術は、トランスジェニックにコード化されたGCaMP、またはAAV媒介GCaMP発現で使用することができ、また、対象となる特定の遺伝的サブセット(すなわち、クレ媒介GCaMP発現)を画像に変更することができる。全体的に、神経節ニューロンのインビボカルシウムイメージングは、末梢の気味ニューロンの活性を監視するための強力な技術であり、より伝統的な全神経脊索のティンパニの記録または味覚行動アッセイに補完的な情報を提供する。
Introduction
哺乳類末梢味システムの重要な成分は、神経節の起源である。耳のピンナを内在させるいくつかの体性感覚ニューロンに加えて、原発は前舌と口蓋を内在させる味覚ニューロンの細胞体で構成される。他の末梢感覚ニューロンと同様に、原発性神経節ニューロンは、長い軸索が味覚芽に末梢に突き出て、そして一元的に孤独な管1の脳幹核に対して擬似ユニポーラである。これらのニューロンは主に口腔内の味覚刺激に反応する味覚受容体細胞によるATPの放出によって活性化される2、3。ATPは、味覚シグナル伝達に不可欠な神経伝達物質であり、そして、その活性化のために、味覚神経節ニューロンによって発現されるP2rx受容体が必要である。味覚受容体細胞が特定の味覚モダリティ(甘味、苦味、塩味、うま味、または酸っぱい)に対する特定の味覚受容体を発現することを考えると、味覚刺激に対する味覚神経節ニューロン応答も狭く調整されるであろうと仮定されている5。
全体の神経録音は、コルダ・タンパニと優れたペトロサル神経の両方が、5つの味覚モダリティすべてを表す射薬信号を、起源の神経節6,7に伝導することを示している。しかし、これはまだ与えられたタスタントに対する神経応答の特異性に関する疑問を残した:味モダリティ特異的ニューロン、ポリモーダルニューロン、またはその両方の混合物がある場合。単繊維の記録は、個々の繊維の活性に関するより多くの情報を与え、その化学的感受性8、9、10を与えるが、この方法論は、少数の繊維からのデータ収集に限定される。同様に、個々のラットの神経節ニューロンのインビボ電気生理学的記録は、個々のニューロン11、12、13の応答に関する情報を与えるが、それでも集団の活性を失い、動物1人あたりのニューロン記録が比較的少ない。個々のニューロンの活動を見失うことなく、ニューロンアンサンブルの応答パターンを分析するためには、新しい技術を採用する必要がありました。
カルシウムイメージングは、特にGCaMPのような遺伝的にコード化されたカルシウム指標を使用して、この技術的なブレークスルー14、15、16、17、18を提供してきました。GCaMPは、神経活動の代理としてカルシウムを使用し、細胞内のカルシウムレベルが上昇するにつれて緑色蛍光を増加させる。GCaMPの新しい形態は、信号対雑音比を改善し、結合性運動を調整し、特殊実験19に適応するために開発され続けている。GCaMPは、神経全体の記録とは異なり、単一のニューロンの解像度を提供し、同時に単一の繊維または単一細胞の記録とは異なり、ニューロンのアンサンブルの応答を測定することができます。原発性神経節のカルシウムイメージングは、野生型マウス16,20におけるこれらのニューロンのチューニングプロファイルに関する重要な情報を既に提供しており、遺伝的に操作されたマウス18における末梢の味の誤配線表現型を同定している。
インビボカルシウムイメージング技術を原発性神経節に適用する際の大きな難点の1つは、骨の鼓膜発作の中にカプセル化されるということです。ジェクレートへの光学的アクセスを得るためには、ガングリオンをそのまま維持しながら、骨の層を除去するために繊細な手術が必要です。そのために、他の研究者が原発性神経節にアクセスし、GCaMPがこれらのニューロンの蛍光応答を媒介して生体内で刺激を味わう画像を画像化するのを助けるために、このガイドを作成しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究は、ジェニュー酸神経節を外科的に暴露し、GCaMP6sでそのニューロンの活動を視覚的に記録するためのステップバイステッププロトコルを記述する。この手順は、前述の17と非常によく似ていますが、いくつかの顕著な例外があります。まず、ヘッドポストを使用することで、手術中の頭部の位置調整が容易になります。第二に、刺激送達に関して、呉とドボヤンチ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、マウスの夫のためにS.フマユンに感謝します。この研究のための資金は、UTSAの脳健康コンソーシアムの卒業生とポスドクシードグラント(B.E.F.)とNIH-SC2-GM130411によってL.J.Mに提供されています。
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
- Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
- Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. Gustatory neural response in the mouse. Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).
- Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
- Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
- Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
- Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).
- Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
- Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
- Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
- Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Rewiring the taste system. Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- . dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014)
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
- Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
- Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
- Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).
