Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi
Summary
Burada canlı, uyuşturuldulu bir laboratuvar faresinin genikül ganglionunun nasıl ortaya çıkarılacağını ve bu nöronların topluluklarının uyaranları tatmak için tepkilerini ölçmek için kalsiyum görüntülemenin nasıl kullanılacağını ve farklı uyarıcılarla birden fazla denemeye izin vermeyi sunuyoruz. Bu, hangi nöronların hangi şok tabancalarına yanıt verdiğine derinlemesine karşılaştırmalar sağlar.
Abstract
Son on yıl içinde, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerindeki (GECI’ler) gelişmeler in vivo fonksiyonel görüntülemede bir devrimi teşvik etti. Kalsiyumun nöronal aktivite için bir proxy olarak kullanılması, bu teknikler büyük nöronal topluluklar içindeki bireysel hücrelerin çeşitli uyaranlara yanıtlarını gerçek zamanlı olarak izlemenin bir yolunu sağlar. Biz ve diğerleri, canlı uyuşturulmuş farelerin dillerine uygulanan uyaranları tatmak için bireysel genikül ganglion nöronlarının yanıtlarını görmek için bu teknikleri uyguladık. Genikül ganglion, ön dili ve damağı içselleştiren gustatory nöronların hücre vücutlarının yanı sıra kulağın pinnasını içselleştiren bazı somatosensör nöronlardan oluşur. GCaMP ile bireysel genikül ganglion nöronlarının tat çağrışımlı yanıtlarının görüntülenmesi, bu nöronların vahşi tip farelerdeki ayarlama profilleri hakkında önemli bilgiler ve genetik olarak manipüle edilmiş farelerde periferik tat yanlış dönen fenotipleri tespit etmenin bir yolunu sağlamıştır. Burada genikül ganglionu, GCaMP floresan görüntü alımını, veri analizi için ilk adımları ve sorun gidermeyi ortaya çıkarmak için cerrahi prosedürü gösteriyoruz. Bu teknik transgenik olarak kodlanmış GCaMP veya AAV aracılı GCaMP ifadesi ile kullanılabilir ve belirli genetik ilgi alt kümelerini (örneğin, Cre aracılı GCaMP ifadesi) görüntülenecek şekilde değiştirilebilir. Genel olarak, genikül ganglion nöronlarının in vivo kalsiyum görüntülemesi periferik gustatory nöronların aktivitesini izlemek için güçlü bir tekniktir ve daha geleneksel tam sinir chorda tympani kayıtlarına veya tat davranışı testlerine tamamlayıcı bilgiler sağlar.
Introduction
Memeli periferik tat sisteminin önemli bir bileşeni genikül gangliondur. Kulağın pinnasını içselleştiren bazı somatosensör nöronlara ek olarak, genikül ön dili ve damağı içselleştiren gustatory nöronların hücre gövdelerinden oluşur. Diğer periferik duyusal nöronlara benzer şekilde, genikül ganglion nöronları, periferik olarak tat tomurcuklarına ve merkezi olarak yalnız sistemin beyin sapı çekirdeğine uzun bir aksla sözde tek kutupludur1. Bu nöronlar öncelikle atp ağız boşluğunda tat uyaranlarına yanıt veren tat reseptör hücreleri tarafından serbest bırakılması ile aktive edilir2,3. ATP tat sinyali için gerekli bir nörotransmitterdir ve gustatory ganglion nöronları tarafından ifade edilen P2rx reseptörleri aktivasyonları için gereklidir4. Tat reseptör hücrelerinin belirli bir tat modalitesi (tatlı, acı, tuzlu, umami veya ekşi) için belirli tat reseptörlerini ifade ettiği göz önüne alındığında, tadı uyaranlara verilen gustatory ganglion nöron yanıtlarının da dar bir şekilde ayarlandırılacağı hipotez edilmiştir5.
Tüm sinir kayıtları hem chorda tympani hem de daha büyük üstün petrosal sinirlerin genikül ganglion6,7’yebeş tat modalitesini temsil eden gustatory sinyalleri iletdiğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu hala belirli bir şok tabancasına nöronal yanıtların özgüllüğü hakkında sorular bıraktı: tat modalitesine özgü nöronlar, polimodal nöronlar veya her ikisinin bir karışımı varsa. Tek lif kayıtları, bireysel liflerin aktivitesi ve kimyasal hassasiyetleri 8,9,10hakkında daha fazla bilgi verir, ancak bu metodoloji az sayıda elyaftan veri toplamakla sınırlıdır. Benzer şekilde, bireysel sıçan genikül ganglion nöronlarının in vivo elektrofizyolojikkayıtları,bireysel nöronların11 , 12,13, yanıtları hakkında bilgi verir, ancak yine de popülasyonun aktivitesini kaybeder ve hayvan başına nispeten az nöron kaydı verir. Nöronal toplulukların yanıt kalıplarını, bireysel nöronların aktivitesini gözden kaçırmadan analiz etmek için yeni tekniklerin çalıştırılması gerekiyordu.
Kalsiyum görüntüleme, özellikle GCaMP gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak, bu teknik atılımı sağlamıştır14,15,16,17,18. GCaMP, kalsiyumu nöronal aktivite için bir proxy olarak kullanır ve hücre içindeki kalsiyum seviyeleri yükseldikçe yeşil floresan artar. Sinyali gürültü oranına iyileştirmek, bağlama kinetiğini ayarlamak ve özel deneyler için uyum sağlamak için yeni GCaMP formları geliştirilmeye devam ediyor19. GCaMP, tüm sinir kaydının aksine tek bir nöron çözünürlüğü sağlar ve aynı anda tek lif veya tek hücre kaydının aksine nöron topluluklarının yanıtlarını ölçebilir. Genikül gangliyonunun kalsiyum görüntülemesi, vahşi tip farelerde bu nöronların ayar profilleri hakkında önemli bilgiler sağlamıştır16,20ve genetik olarak manipüle edilmiş farelerde periferik tat yanlış yönlendiren fenotipler tanımlamıştır18.
Genikül ganglionuna in vivo kalsiyum görüntüleme tekniklerinin uygulanmasının en büyük zorluklarından biri kemikli tympanic bulla içinde kapsüllenmiş olmasıdır. Geniküle optik erişim elde etmek için, ganglionu sağlam tutarken kemik katmanlarını çıkarmak için hassas bir ameliyat gerekir. Bu amaçla, diğer araştırmacıların genikül ganglion’a erişmelerine ve GCaMP’nin bu nöronların uyarıcı in vivo tatmak için floresan yanıtlarına aracılık ettiğini göstermelerine yardımcı olmak için bu kılavuzu oluşturduk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, genikül ganglionu cerrahi olarak ortaya çıkarmak ve nöronlarının GCaMP6’larla aktivitesini görsel olarak kaydetmek için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. Bu prosedür çok benzer daha önce açıklanan17, birkaç önemli istisna dışında. İlk olarak, bir kafa direğinin kullanılması, ameliyat sırasında kafa konumlandırmasının kolay ayarını sağlar. İkincisi, uyaran teslimatı ile ilgili olarak, Wu ve Dvoryanchikov’un yaklaşımı, yemek borusu tüpü<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar fare hayvancılığı için S. Humayun’a teşekkür eder. Bu çalışma için finansman kısmen UTSA’nın Beyin Sağlığı Konsorsiyumu Mezunu ve Doktora Sonrası Tohum Hibesi (B.E.F.) ve NIH-SC2-GM130411 tarafından L.J.M.’ye sağlanmıştır.
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
- Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
- Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. Gustatory neural response in the mouse. Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).
- Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
- Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
- Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
- Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).
- Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
- Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
- Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
- Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Rewiring the taste system. Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- . dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014)
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
- Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
- Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
- Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).
