In vivo Кальциевая визуализация реакции ганглионных нейронов мыши на вкусовые стимулы
Summary
Здесь мы представляем, как разоблачить геникулированный ганглий живой, анестезированной лабораторной мыши и как использовать кальциевую визуализацию для измерения реакций ансамблей этих нейронов на вкусовые стимулы, что позволяет проводить многочисленные испытания с различными стимуляторами. Это позволяет проводить глубокие сравнения того, какие нейроны реагируют на какие вкусности.
Abstract
В течение последних десяти лет достижения в области генетически закодированных показателей кальция (GECIs) способствовали революции в функциональной визуализации in vivo. Используя кальций в качестве прокси для нейронной активности, эти методы обеспечивают способ мониторинга реакций отдельных клеток в больших нейронных ансамблях на различные стимулы в режиме реального времени. Мы и другие применили эти методы для изображения реакций отдельных геникулятных ганглиевых нейронов на вкусовые стимулы, применяемые к языкам живых обезболенных мышей. Геникулированный ганглий состоит из клеточных тел вкусовых нейронов, иннервирующих передний язык и небо, а также некоторых соматосенсорных нейронов, иннервирующих ушную конечность уха. Визуализация вызванных вкусом реакций отдельных геникулятных ганглиозных нейронов с помощью GCaMP предоставила важную информацию о профилях настройки этих нейронов у мышей дикого типа, а также способ обнаружения периферических вкусовых искажений фенотипов у генетически манипулируемых мышей. Здесь мы демонстрируем хирургическую процедуру для выявления геникулятного ганглия, получение флуоресцентного изображения GCaMP, начальные шаги для анализа данных и устранения неполадок. Этот метод может быть использован с трансгенно закодированным GCaMP или с AAV-опосредороженной экспрессией GCaMP и может быть модифицирован для изображения конкретных генетических подмножеств, представляющих интерес (т. Е. Cre-опосредованной экспрессии GCaMP). В целом, визуализация кальция in vivo геникулятных ганглийных нейронов является мощным методом мониторинга активности периферических вкусовых нейронов и предоставляет дополнительную информацию к более традиционным записям цельнонерального хорды или анализам вкусового поведения.
Introduction
Ключевым компонентом периферической вкусовой системы млекопитающих является геникулированный ганглий. В дополнение к некоторым соматосенсорным нейронам, которые иннервируют ушную конечность уха, геникулят состоит из клеточных тел вкусовых нейронов, иннервирующих передний язык и небо. Подобно другим периферическим сенсорным нейронам, геникулятные ганглиозные нейроны являются псевдоуниполярными с длинным аксоном, выступающим периферически к вкусовым рецепторам и центрально к ядру ствола мозга одиночного тракта1. Эти нейроны активируются в первую очередь высвобождением АТФ клетками вкусовых рецепторов, реагирующих на вкусовые раздражители в ротовой полости2,3. АТФ является важным нейромедиатором для передачи сигналов вкуса, а рецепторы P2rx, экспрессируемые вкусовыми ганглиозными нейронами, необходимы для их активации4. Учитывая, что клетки вкусовых рецепторов экспрессируют специфические вкусовые рецепторы для определенной модальности вкуса (сладкий, горький, соленый, умами или кислый), было выдвинуто, что реакции вкусовых ганглиозных нейронов на вкусовые стимулы также будут узко настроены5.
Целые нервные записи показали, что как хорда tympani, так и большие высшие петрозальные нервы проводят вкусовые сигналы, представляющие все пять вкусовых модальностей к геникулированному ганглию6,7. Однако это все еще оставлял вопросы о специфичности нейронных реакций на данный вкус: есть ли вкусовая модальность специфических нейронов, полимодальных нейронов или смеси того и другого. Одиночные записи волокон дают больше информации об активности отдельных волокон и их химической чувствительности8,9,10,но эта методология ограничивается сбором данных из небольшого количества волокон. Аналогичным образом, электрофизиологические записи in vivo отдельных геникулятных ганглиозных нейронов крыс дают информацию об ответах отдельных нейронов11,12,13,но все же теряют активность популяции и дают относительно мало нейронных записей на одно животное. Чтобы проанализировать паттерны реакции нейронных ансамблей, не упуская из виду активность отдельных нейронов, необходимо было использовать новые методы.
Визуализация кальция, особенно с использованием генетически закодированных показателей кальция, таких как GCaMP, обеспечила этот технический прорыв14,15,16,17,18. GCaMP использует кальций в качестве прокси для активности нейронов, увеличивая зеленую флуоресценцию по мере повышения уровня кальция в клетке. Продолжают разрабатываться новые формы GCaMP для улучшения отношения сигнал/шум, регулировки кинетики связывания и адаптации к специализированным экспериментам19. GCaMP обеспечивает разрешение одного нейрона, в отличие от записи всего нерва, и может одновременно измерять ответы ансамблей нейронов, в отличие от записи одного волокна или одной клетки. Кальциевая визуализация геникулятных ганглиев уже предоставила важную информацию о профилях настройки этих нейронов у мышей дикого типа16,20и выявила периферические вкусовые искажения фенотипов у генетически манипулируемых мышей18.
Одна из основных трудностей применения методов визуализации кальция in vivo к геникулятному ганглию заключается в том, что он инкапсулирован в костную тимпаническую буллу. Чтобы получить оптический доступ к геникуляту, требуется деликатная операция по удалению слоев костей, сохраняя при этом ганглий нетронутым. С этой целью мы создали это руководство, чтобы помочь другим исследователям получить доступ к геникулятному ганглию и изобразить опосредованные GCaMP флуоресцентные реакции этих нейронов на вкус стимулов in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа описывает пошаговый протокол для хирургического обнажения геникулятного ганглия и визуальной записи активности его нейронов с помощью GCaMP6s. Эта процедура очень похожа на описаннуюранее 17,за несколькими заметными исключениями. Во-первых, использование головно?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят С. Хумаюна за разведение мышей. Финансирование этой работы было частично предоставлено Консорциумом по здоровью мозга UTSA Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) и NIH-SC2-GM130411 для L.J.M.
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
- Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
- Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. Gustatory neural response in the mouse. Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).
- Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
- Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
- Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
- Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).
- Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
- Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
- Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
- Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Rewiring the taste system. Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- . dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014)
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
- Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
- Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
- Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).
