In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם
Summary
כאן אנו מציגים כיצד לחשוף את גנגליון geniculate של עכבר מעבדה חי, מרדים וכיצד להשתמש הדמיית סידן כדי למדוד את התגובות של הרכבים של נוירונים אלה לטעום גירויים, המאפשר ניסויים מרובים עם ממריצים שונים. זה מאפשר השוואות מעמיקות של אילו נוירונים מגיבים לאו תיוהמים.
Abstract
בעשר השנים האחרונות, ההתקדמות במדדי סידן (GECIs) המקודדים גנטית קידמה מהפכה בהדמיה תפקודית של vivo. באמצעות סידן כבא כוח לפעילות עצבית, טכניקות אלה מספקות דרך לפקח על התגובות של תאים בודדים בתוך הרכבים עצביים גדולים למגוון גירויים בזמן אמת. אנחנו, ואחרים, יישמנו טכניקות אלה כדי לדמיין את התגובות של נוירונים גנגליון geniculate בודדים לטעום גירויים להחיל על הלשונות של עכברים מרדים חיים. הגנגליון הגנולט מורכב מגופי התא של נוירונים גוסטטוריים המחדירים את הלשון והחך העורפיים, כמו גם כמה נוירונים סומטוסנסוריים המחדירים את הפינה של האוזן. הדמיית התגובות מעוררות הטעם של נוירוני גנגליון geniculate בודדים עם GCaMP סיפק מידע חשוב על פרופילי כוונון של נוירונים אלה בעכברים מסוג בר, כמו גם דרך לזהות פנוטיפים טעם היקפי miswiing בעכברים מניפולציה גנטית. כאן אנו מדגימים את ההליך הכירורגי כדי לחשוף את גנגליון geniculate, רכישת תמונה פלואורסצנטית GCaMP, צעדים ראשוניים לניתוח נתונים, ופתרון בעיות. טכניקה זו יכולה לשמש עם GCaMP מקודד מהונדס, או עם ביטוי GCaMP בתיווך AAV, וניתן לשנות אותה לתמונה תת-קבוצות גנטיות מסוימות של עניין (כלומר, ביטוי GCaMP בתיווך Cre). בסך הכל, בהדמיית סידן ויו של נוירוני גנגליון geniculate היא טכניקה רבת עוצמה לניטור הפעילות של נוירונים גוסטטוריים היקפיים ומספקת מידע משלים להקלטות מסורתיות יותר של chorda tympani עצב שלם או טעם התנהגות ישבן.
Introduction
מרכיב מרכזי במערכת הטעם ההיקפית של היונקים הוא גנגליון geniculate. בנוסף לכמה נוירונים סומטוסנסוריים המ innervate את הפינה של האוזן, geniculate מורכב מגופי התא של נוירונים gustatory innervating הלשון והחך הצפוניים. בדומה לנוירונים חושיים היקפיים אחרים, נוירוני הגנגליון הגנולטים הם פסאודו-חד קוטביים עם אקסון ארוך המקרין באופן היקפי לבלוטות הטעם, ובמרכז לגרעין גזע המוח של מערכת הבודדת1. נוירונים אלה מופעלים בעיקר על ידי שחרור של ATP על ידי תאי קולטן טעם המגיבים לגירויים טעם בחלל הפה2,3. ATP הוא נוירוטרנסמיטר חיוני עבור איתות טעם, קולטני P2rx לידי ביטוי על ידי נוירונים גנגליון gustatory נחוצים להפעלתם4. בהתחשב בכך שתאי קולטן הטעם מבטאים קולטני טעם ספציפיים עבור מודאליות טעם מסוימת (מתוק, מריר, מלוח, אומאמי, או חמוץ), ההשערה היא כי תגובות נוירון גנגליון gustatory טעם גירויים יהיה גם מכוון בקושי5.
הקלטות עצבים שלמות הראו הן את chorda tympani ואת העצבים פטרוסאלי מעולה גדול יותר לבצע אותות gustatory המייצגים את כל חמש שיטות הטעם כדי גנגליון geniculate6,7. עם זאת, זה עדיין השאיר שאלות על הספציפיות של תגובות עצביות לטעם נתון: אם יש מודאליות טעם נוירונים ספציפיים, נוירונים פולימודליים, או תערובת של שניהם. הקלטות סיבים בודדים לתת מידע נוסף על הפעילות של סיבים בודדים רגישויות כימיות שלהם8,9,10, אבל מתודולוגיה זו מוגבלת לאיסוף נתונים ממספר קטן של סיבים. באופן דומה, בהקלטות אלקטרופיזיולוגיות vivo של נוירוני גנגליון geniculate חולדה בודדים לתת מידע על התגובות של נוירונים בודדים11,12,13, אבל עדיין מאבד את הפעילות של האוכלוסייה ומניב הקלטות נוירון מעט יחסית לכל חיה. על מנת לנתח את דפוסי התגובה של הרכבים עצביים מבלי לאבד את הפעילות של נוירונים בודדים, טכניקות חדשות צריך להיות מועסק.
הדמיית סידן, במיוחד באמצעות אינדיקטורים סידן מקודד גנטית כמו GCaMP, סיפק פריצת דרך טכנית זו14,15,16,17,18. GCaMP משתמש בסידן כבא כוח לפעילות עצבית, הגדלת פלואורסצנטיות ירוקה ככל שרמות הסידן בתוך התא עולות. צורות חדשות של GCaMP ממשיכות להיות מפותחות כדי לשפר את יחס האות לרעש, להתאים קינטיקה מחייבת, ולהתאים לניסויים מיוחדים19. GCaMP מספק רזולוציית נוירון יחיד, שלא כמו הקלטת עצב שלמה, והוא יכול בו זמנית למדוד תגובות של הרכבים של נוירונים, שלא כמו סיב יחיד או הקלטת תא יחיד. הדמיית סידן של הגרעינים geniculate כבר סיפק מידע חשוב על פרופילי כוונון של נוירונים אלה בעכברים מסוג בר16,20, וזיהה טעם היקפי חיווט פנוטיפים במניפולציה גנטית עכברים18.
אחד הקושיים העיקריים ליישם בטכניקות הדמיית סידן ויוו על גנגליון geniculate הוא שזה עטוף בתוך בולה טימפנית גרמית. על מנת לקבל גישה אופטית geniculate, ניתוח עדין נדרש כדי להסיר את שכבות העצמות, תוך שמירה על הגנגליון שלם. לשם כך, יצרנו מדריך זה כדי לעזור לחוקרים אחרים לגשת לגנגליון geniculate ולדמות את GCaMP מתווך תגובות פלואורסצנטיות של נוירונים אלה לטעום גירויים ב vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מתארת פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לחשוף בניתוח את גנגליון geniculate ולתעד חזותית את הפעילות של הנוירונים שלה עם GCaMP6s. הליך זה דומה מאוד לזה שתואר קודם לכן17, עם כמה יוצאים מן הכלל בולטים. ראשית, השימוש בתנוחת ראש מאפשר התאמה קלה של מיצוב הראש במהלך הניתוח. שנית, לגבי משלוח גירוי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לס. הומאיון על גידול העכברים. מימון עבור עבודה זו ניתן בחלקו על ידי בוגר הקונסורציום לבריאות המוח של UTSA ומענק זרע פוסט-דוקטורט (B.E.F.) ו- NIH-SC2-GM130411 ל- L.J.M.
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
- Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
- Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. Gustatory neural response in the mouse. Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).
- Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
- Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
- Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
- Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).
- Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
- Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
- Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
- Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Rewiring the taste system. Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- . dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014)
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
- Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
- Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
- Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).
