In vivo kalsiumavbildning av mus Geniculate Ganglion Neuron Responser på smak stimuli
Summary
Her presenterer vi hvordan man eksponerer den geniculate ganglion av en levende, bedøvet laboratoriemus og hvordan du bruker kalsiumavbildning for å måle svarene til ensembler av disse nevronene for å smake stimuli, noe som gir mulighet for flere forsøk med forskjellige sentralstimulerende midler. Dette gir mulighet for grundige sammenligninger av hvilke nevroner som reagerer på hvilke smaksstoffer.
Abstract
I løpet av de siste ti årene har fremskritt innen genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) fremmet en revolusjon innen in vivo funksjonell avbildning. Ved å bruke kalsium som proxy for nevronaktivitet, gir disse teknikkene en måte å overvåke responsen til individuelle celler i store nevronale ensembler til en rekke stimuli i sanntid. Vi, og andre, har brukt disse teknikkene for å avbilde svarene til individuelle geniculate ganglion nevroner for å smake stimuli påført tungene til levende bedøvede mus. Den geniculate ganglion består av cellelegemer av gustatory nevroner som innerverer fremre tunge og gane, samt noen somatosensoriske nevroner som innerverer ørets pinna. Avbildning av smaksfremkallende responser fra individuelle geniculate ganglion neuroner med GCaMP har gitt viktig informasjon om tuningprofilene til disse nevronene i ville mus, samt en måte å oppdage perifer smak som feilsefinerer fenotyper hos genetisk manipulerte mus. Her demonstrerer vi den kirurgiske prosedyren for å eksponere geniculate ganglion, GCaMP fluorescence image acquisition, innledende trinn for dataanalyse og feilsøking. Denne teknikken kan brukes med transgent kodet GCaMP, eller med AAV-mediert GCaMP-uttrykk, og kan endres til bildespesifikke genetiske delsett av interesse (dvs. Cre-mediert GCaMP-uttrykk). Totalt sett er in vivo kalsiumavbildning av geniculate ganglion neuroner en kraftig teknikk for å overvåke aktiviteten til perifere gustatory nevroner og gir komplementær informasjon til mer tradisjonelle helnerve chorda tympani-opptak eller smaksadferdsanalyser.
Introduction
En nøkkelkomponent i pattedyrets perifere smakssystem er den geniculate ganglion. I tillegg til noen somatosensoriske nevroner som innervaterer ørets pinna, består geniculatet av cellelegemene til gustatory nevroner som innerverer den fremre tungen og ganen. I likhet med andre perifere sensoriske nevroner er de geniculate ganglion nevronene pseudo-unipolar med en lang axon som projiserer perifert til smaksløkene, og sentralt til hjernestammekjernen i den ensomme kanalen1. Disse nevronene aktiveres hovedsakelig ved frigjøring av ATP av smaksreseptorceller som reagerer på smakstimuli i munnhulen2,3. ATP er en viktig nevrotransmitter for smaksignalering, og P2rx reseptorer uttrykt av gustatory ganglion nevroner er nødvendige for aktivering4. Gitt at smaksreseptorceller uttrykker spesifikke smaksreseptorer for en bestemt smaksmodalitet (søt, bitter, salt, umami eller sur), har det blitt hypoteset at gustatory ganglion neuron responser på smakstimuli også ville være smalt innstilt5.
Hele nerveopptak har vist både chorda tympani og de større overlegne petrosale nervene utfører gustatory signaler som representerer alle fem smak modaliteter til geniculate ganglion6,7. Dette etterlot imidlertid fortsatt spørsmål om spesifisiteten av nevronale responser på en gitt tastant: hvis det er smakmodalitetsspesifikke nevroner, polymodale nevroner eller en blanding av begge deler. Enkeltfiberopptak gir mer informasjon om aktiviteten til individuelle fibre og deres kjemiske følsomheter8,9,10, men denne metoden er begrenset til å samle inn data fra et lite antall fibre. På samme måte gir in vivo elektrofysiologiske registreringer av individuelle rottegenululate ganglion nevroner informasjon om svarene til individuelle nevroner11,12,13, men mister fortsatt befolkningens aktivitet og gir relativt få nevronopptak per dyr. For å analysere responsmønstrene til nevronale ensembler uten å miste av syne aktiviteten til individuelle nevroner, måtte nye teknikker brukes.
Kalsiumavbildning, spesielt ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer som GCaMP, har gitt dette tekniske gjennombruddet14,15,16,17,18. GCaMP bruker kalsium som proxy for nevronaktivitet, noe som øker grønn fluorescens etter hvert som kalsiumnivået i cellen stiger. Nye former for GCaMP fortsetter å bli utviklet for å forbedre signal-til-støy-forholdet, justere bindende kinetikk og tilpasse seg spesialiserte eksperimenter19. GCaMP gir enkel nevronoppløsning, i motsetning til hel nerveopptak, og kan samtidig måle svar av ensembler av nevroner, i motsetning til enkeltfiber eller enkeltcelleopptak. Kalsiumavbildning av geniculate ganglia har allerede gitt viktig informasjon om tuningprofilene til disse nevronene i villtype mus16,20, og har identifisert perifer smak feilwiring fenotyper i genetisk manipulerte mus18.
En stor vanskelighet med å bruke in vivo kalsiumavbildningsteknikker på geniculate ganglion er at den er innkapslet i den benete tympaniske bulla. For å få optisk tilgang til geniculatet, er det nødvendig med delikat kirurgi for å fjerne lagene av bein, samtidig som ganglionen holdes intakt. For det formålet har vi laget denne guiden for å hjelpe andre forskere med å få tilgang til geniculate ganglion og bilde GCaMP medierte fluorescerende responser fra disse nevronene for å smake stimuli in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbeidet beskriver en trinnvis protokoll for kirurgisk eksponering av geniculate ganglion og visuelt registrere aktiviteten til nevronene med GCaMP6s. Denne prosedyren er veldig lik den som er beskrevet tidligere17, med noen få bemerkelsesverdige unntak. For det første gir bruk av en hodestolpe enkel justering av hodeposisjonering under operasjonen. For det andre, når det gjelder stimulanslevering, strømmer tilnærmingen til Wu og Dvoryanchikov stimuli gjennom esophageal tubing<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker S. Humayun for musehold. Støtten til dette arbeidet er delvis gitt av UTSAs Brain Health Consortium Graduate and Postdoctoral Seed Grant (B.E.F.) og NIH-SC2-GM130411 til L.J.M.
Materials
| 1 x #5 Inox Forceps | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| 1ml Syringe with luer lock | Fisher Scientific | 14-823-30 | |
| 2 x #3 Inox Forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 Gauge Blunt Dispensing Needle | Fisher Scientific | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 Machine Screw Hex Nuts | Fastenere | 3SNMS004C | |
| 4-40 Socket Head Cap Screw | Fastenere | 3SSCS04C004 | |
| Absorbent Points | Fisher Scientific | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| Artificial Tears | Akorn | 59399-162-35 | |
| BD Allergist Trays with Permanently Attached Needle | Fisher Scientific | 14-829-6D | |
| Blunt Retractors | FST | 18200-09 | |
| Breadboard | Thor Labs | MB8 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A95-3 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | |
| Contemporary Ortho-Jet Liquid | Lang | 1504 | |
| Contemporary Ortho-Jet Powder | Lang | 1520 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher | 19-062-616 | |
| Custom Head Post Holder | eMachineShop | See attached file 202410.ems | |
| Custom Metal Head Post | eMachineShop | See attached file 202406.ems | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Digital Camera, sCMOS OrcaFlash4 Microscope Mounted | Hamamatsu | C13440 | |
| Disection Scope | Leica | M80 | |
| Hair Clippers | Kent Scientific | CL7300-Kit | |
| IMP | Fisher Scientific | AAJ6195906 | |
| Ketamine | Ketaved | NDC 50989-996-06 | |
| LED Cold Light Source | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock 1/16" Tubing Adapters | Fisher | 01-000-116 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | |
| Mini-series Optical Posts | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | Fisher Scientific | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 Rotatable probe Clamp | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Pressurized air | Airgas | AI Z300 | |
| Quinine | Fisher Scientific | AC163720050 | |
| Self Sticking Labeling Tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Silicone Pinch Valve Tubing 1/32" x 1/16" o.d. (per foot) | Automate Scientific | 05-14 | |
| Sola SM Light Engine | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical Probe | Roboz Surgical Store | RS-6067 | |
| Surgical Probe Holder | Roboz Surgical Store | RS-6061 | |
| Thread | Gütermann | 02776 | |
| BD Intramedic Tubing | Fisher Scientific | 22-046941 | |
| Two Stage Gas Regulator | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| Tygon vinyl tubing – 1/16" | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 digital/manual controller | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 Pinch Valve Perfusion System | Automate Scientific | 17-pp-54 | |
| Xylazine | Anased | NADA# 139-236 |
References
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, 4 (2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP channel. Bioessays. (35), 1111-1118 (2013).
- Taruno, A., et al. Taste transduction and channel synapses in taste buds. Pflugers Archiv-European Journal of Physiology. 473, 3-13 (2021).
- Kinnamon, S. C., Finger, T. E. A taste for ATP: neurotransmission in taste buds. Frontiers in Cell Neuroscience. 7, 264 (2013).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. Common sense about taste: from mammals to insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Ninomiya, Y., Tonosaki, K., Funakoshi, M. Gustatory neural response in the mouse. Brain Research. 244 (2), 370-373 (1982).
- Formaker, B. K., MacKinnon, B. I., Hettinger, T. P., Frank, M. E. Opponent effects of quinine and sucrose on single fiber taste responses of the chorda tympani nerve. Brain Research. 772 (1-2), 239-242 (1997).
- Frank, M. The classification of mammalian afferent taste nerve fibers. Chemical Senses. 1 (1), 53-60 (1974).
- Ogawa, H., Yamashita, S., Sato, M. Variation in gustatory nerve fiber discharge pattern with change in stimulus concentration and quality. Journal of Neurophysiology. 37 (3), 443-457 (1974).
- Sollars, S. I., Hill, D. L. In vivo recordings from rat geniculate ganglia: taste response properties of individual greater superficial petrosal and chorda tympani neurones. Journal of Physiology. 564, 877-893 (2005).
- Yokota, Y., Bradley, R. M. Geniculate ganglion neurons are multimodal and variable in receptive field characteristics. Neuroscience. 367, 147-158 (2017).
- Breza, J. M., Curtis, K. S., Contreras, R. J. Temperature modulates taste responsiveness and stimulates gustatory neurons in the rat geniculate ganglion. Journal of Neurophysiology. 95 (2), 674-685 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits: A decade of progress. Neuron. 98 (4), 865 (2018).
- Barreto, R. P. J., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517, 373-376 (2015).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G. Live animal calcium imaging of the geniculate ganglion. Protocol Exchange. , 106 (2015).
- Lee, H., Macpherson, L. J., Parada, C. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Rewiring the taste system. Nature. 548 (7667), 330-333 (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6, 8171 (2015).
- Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
- . dF Over F movie ImageJ Plugin Available from: https://gist.github.com/ackman678/5817461 (2014)
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, (2019).
- Zhang, J., et al. Sour sensing from the tongue to the brain. Cell. 179 (2), 392-402 (2019).
- Lee, D., Kume, M., Holy, T. E. A molecular logic of sensory coding revealed by optical tagging of physiologically-defined neuronal types. bioRxiv. , 692079 (2019).
- Moeyaert, B., et al. Improved methods for marking active neuron populations. Nature Communication. 9 (1), 4440 (2018).
