Summary
Vi beskriver ett snabbt och robust protokoll för att berika invarianta naturliga killer T (iNKT) celler från mus mjälte och expandera dem in vitro till lämpliga nummer för in vitro och in vivo studier.
Abstract
Invariant Natural Killer T (iNKT) celler är medfödda-liknande T Lymfocyter uttrycker en bevarad semi-invariant T cell receptor (TCR) specifik för själv eller mikrobiella lipid antigener presenteras av den icke-polymorfa MHC klass I-relaterade molekylen CD1d. Prekliniska och kliniska studier stöder en roll för iNKT celler i cancer, autoimmunitet och infektionssjukdomar. iNKT-celler är mycket bevarade i hela arten och deras undersökning har underlättats av musmodeller, inklusive CD1d-bristfälliga eller iNKT-bristfälliga möss, och möjligheten att otvetydigt upptäcka dem hos möss och män med CD1d-tetramerer eller mAbs som är specifika för semiinvariant TCR. INKT-celler är dock sällsynta och de måste utökas för att nå hanterbara siffror för alla studier. Eftersom genereringen av primära mus iNKT cellinje in vitro har visat sig svårt, har vi inrättat ett robust protokoll för att rena och expandera mjälte iNKT celler från iVα14-Jα18 transgena möss (iVα14Tg), där iNKT celler är 30 gånger vanligare. Vi visar här att primära splenic iVα14Tg iNKT celler kan berikas genom en immunomagnetisk separation process, vilket ger ca 95-98% ren iNKT celler. De renade iNKT-cellerna stimuleras av anti-CD3/CD28 pärlor plus IL-2 och IL-7, vilket resulterar i 30-faldig expansion på dag +14 av kulturen med 85-99% renhet. De expanderade iNKT-cellerna kan lätt manipuleras genetiskt, vilket ger ett ovärderligt verktyg för att dissekera mekanismer för aktivering och funktion in vitro och, ännu viktigare, även vid adoptivöverföring in vivo.
Introduction
Invarianta naturliga mördar T-celler (iNKT-celler) är medfödda T-lymfocyter som uttrycker en semi-invariant αβ T-cellsreceptor (TCR), bildad hos möss av en invariant Vα14-Jα18-kedja parad med en begränsad uppsättning olika Vβ-kedjor1, vilket är specifikt för lipidantigener som presenteras av MHC-klass I-relaterad molekyl CD1d2. iNKT-celler genomgår ett agonistiskt urvalsprogram som resulterar i förvärv av en aktiverad /medfödd effektorfenotyp redan i tymus, som sker genom flera mognadsstadier3,4, som producerar en CD4+ och en CD4- delmängd. Genom detta program förvärvar iNKT-celler distinkta T helper (TH)effector fenotyper, nämligen TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) och TH17 (iNKT17), identifierbar genom uttryck av transkriptionsfaktorerna T-bet, GATA3, PLZF respektive RORγt,respektive 5. iNKT-celler känner igen en rad mikrobiella lipider men är också självreaktiva mot endogena lipider som är uppreglerade i samband med patologiska situationer av cellstress och vävnadsskador, såsom cancer och autoimmunitet2. Vid aktivering modulerar iNKT-celler funktionerna hos andra medfödda och adaptiva immuneffektorceller via direktkontakt och cytokinproduktion2.
Undersökningarna av iNKT-celler har underlättats av musmodeller, inklusive CD1d-bristfälliga eller Jα18-bristfälliga möss, och genom produktion av antigenbelastade CD1d-tetramerer plus generering av monoklonala antikroppar (mAbs) som är specifika för den mänskliga semiinvarianta TCR. Genereringen av primära musen iNKT cellinje har dock visat sig svårt. För att bättre karakterisera antitumörfunktionerna hos iNKT-celler och för att använda dem för adoptivcellsterapi, inrättar vi ett protokoll för att rena och expandera splenic iNKT-celler av iVα14-Jα18 transgena möss (iVα14Tg)6, där iNKT-celler är 30 gånger vanligare än hos vilda möss.
Expanderade iNKT-celler kan utnyttjas för in vitro-analyser och in vivo vid överföring tillbaka till möss. I den här inställningen har vi till exempel visat deras potenta antitumöreffekter7. Dessutom är in vitro-utökade iNKT-celler mottagliga för funktionell modifiering via genöverföring eller redigering före injektionen in vivo8, vilket möjliggör insiktsfull funktionell analys av molekylära vägar, samt banar väg för avancerade cellterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De förfaranden som beskrivs här granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (nr 1048) vid San Raffaele Scientific Institute.
OBS: Alla procedurer måste utföras under sterila förhållanden. Alla reagenser som används anges i tabellen över material.
1. Mjältebehandling
- Avliva iVα14-Jα18 möss genom inandning av CO2 enligt den institutionella politiken.
OBS: iVα14-Jα18 möss måste vara 8 veckor gamla eller äldre. För att undvika avstötning av cellerna från in vivo-överföringen av cellerna, tänk på att celler som isolerats från honmöss kan överföras adoptivt både hos manliga och kvinnliga mottagare, medan celler som isolerats från hanmöss endast kan överföras till manliga mottagare. För in vitro-experiment får ingen könsfördomar beaktas. Fler möss kan poolas för att få fler celler. - Dissekera musmusmusen och krossa den genom en 70 nm cellsil för att få en encellig suspension i 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 2% fetalt bovinserum (FBS).
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten genom inversion och bearbeta med erytrocyt lysbuffert. Återsuspend cellpelleten med 1 ml steril ACK (Ammonium-klorid-kalium) Lysing Buffer, inkubera i 3 min vid rumstemperatur och blockera med 5 ml PBS med 2% FBS. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
OBS: ACK är kommersiellt tillgängligt; Den består av en lösning på 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3och 0,1 mM Na2EDTA (etylendiamintetraättetiksyra) upplöst i bidistilled H2O, pH 7,2-7,4. Om hemlagad, sterilisera genom filtrering med ett 0,22 μm-filter. - Ta bort supernatanten genom inversion. Återanvänd cellpelleten i 3 ml PBS med 2% FBS och ta bort fettrester genom pipettering. Om det behövs, slå samman cellerna som kommer från olika möss.
- Räkna cellerna och behåll 50 μL för FACS-analys.
2. T-cellsberikning
OBS: För anrikningsstegen, arbeta snabbt, håll cellerna kalla och använd lösningar förkylda vid 4 °C över natten och sedan hålls på is
- Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
- Återsuspend alla celler i lämplig mängd PBS med 2% FBS (500 μL för 107 celler) och Fc blockerare (2,5 μL x 107 celler); inkubera i 15 min vid rumstemperatur (RT).
- Tvätta med 1-2 ml MACS-separationsbuffert (MB) per 107 celler och centrifugera vid 300 x g i 10 min.
MACS-bufferten är kommersiellt tillgänglig. Den består av PBS pH 7,2, 0,5% bovin serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA. Om hemlagad, sterilisera genom filtrering med ett 0,22 μm-filter. - Ta bort supernatanten genom inversion och färga cellerna med CD19-FITC och H2(IA b)-FITC (använd 5 μL x 107 celler i 100 μL MB). Blanda väl och inkubera i 15 min i mörker vid 4-8 °C.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1−2 ml MB per 107 celler och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter.
- Pipettera av supernatanten helt och återanslut cellpelleten i 90 μL MB per 107 totala celler. Tillsätt 10 μL Anti-FITC MicroBeads per 107 totala celler. Blanda väl och inkubera i 15 min i mörker vid 4-8 °C.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1−2 ml MB per 107 celler och centrifugera vid 300 x g i 10 min.
- Pipetten helt och hållet av supernatanten och återanvänd upp till 1,25 x 108 celler i 500 μL MB.
- Placera en LD-kolumn i macs-separatorns magnetfält för att fortsätta till utarmningen. För att undvika igensättning, applicera ett förseparationsfilter på LD-kolonnen och skölj med 2 ml MB.
- När kolonnbehållaren är tom applicerar du cellupphängningen på filtret. Samla in de omärkta cellerna som passerar genom kolumnen.
- Tvätta 3 gånger med 1 ml MB, endast när kolonnbehållaren är tom. Samla in det totala utflödet, som kommer att berikas i T-celler, och räkna cellerna. Behåll alltid 50 μL för FACS-analys.
3. iNKT-cellberikning
- Centrifugera vid 300 x g i 5 minuter och ta bort supernatanten genom inversion.
- Färga cellerna med CD1d-tetramer-PE (mus PBS57-CD1d-tetramer), enligt antikroppstitrering i 50 μL MB per 106 celler. Blanda väl och inkubera i 30 min i mörkret på is.
OBS: Förfarandet kan också utföras med APC-märkta mCD1d tetramerer och anti-APC pärlor; justera fluorokromerna som används vid följande färgning i enlighet med detta. I det nuvarande protokollet använde vi mus PBS-57-CD1d-tetramers som tillhandahålls av NIH. αgalactosylceramid (αGal-Cer) är prototypantigen som känns igen av iNKT-celler. PBS-57 är en analog till αGal-Cer med förbättrad löslighet9; NIH Tetramer Facility tillhandahåller PBS-57 ligand komplex till CD1d tetramerer. Andra CD1d dimers/tetramers/dextramers är dock kommersiellt tillgängliga och kan laddas med ett lipidiskt antigen som αGal-Cer. Vi ser framför oss möjligheten att justera protokollet för deras användning. - Tvätta cellerna genom att tillsätta 1−2 ml MB per 107 celler och centrifugera vid 300 x g i 10 min.
- Pipettera av supernatanten helt och återanvända cellpelleten i 80 μL MB per 107 totala celler. Tillsätt 20 μL Anti-PE MicroBeads per 107 totala celler. Blanda väl och inkubera i 15 min i mörker vid 4-8 °C.
- Tvätta cellerna genom att tillsätta 1−2 ml MB per 107 celler och centrifugera vid 300 x g i 10 minuter.
- Pipettera av supernatanten helt och återanvänd upp till 108 celler i 500 μL MB. Annars om cellerna överstiger 108justerar du volymen i enlighet därmed.
- Placera en LS-kolumn (upp till 108)eller MS (upp till 107)i macs-separatorns magnetfält enligt cellantalet (upp till 10 8 ). Skölj kolonnen med MB (3 ml för LS, 500 μL för MS).
- Applicera cellupphängningen på kolonnen.
- Samla omärkta celler som passerar. Tvätta kolonnen 3 gånger genom att lägga till lämplig mängd MB (3 x 3 ml för LS-kolonn, 3 x 500 μL för MS-kolonnen) endast när kolonnbehållaren är tom. Det totala utflödet är den negativa fraktionen.
- Ta bort kolonnen från magnetfältet och placera den på ett nytt uppsamlingsrör.
- Pipettera MB på kolonnen (5 ml för LS-kolumn eller 1 ml för MS-kolumn); tryck in den medföljande kolven i kolonnen och spola ut den positiva fraktionen (berikad i iNKT-celler).
- För att ytterligare öka återhämtningen av iNKT-cellen, centrifugera den negativa fraktionen vid 300 x g i 10 minuter och upprepa steg 3,6-3,7 med en ny LS- eller MS-kolumn. Poola de positiva fraktionerna och bestäm antalet celler. Håll 50 μL av både positiva och negativa fraktioner för FACS-analys.
- Kontrollera reningsstegen genom FACS-analys. Exempel inkluderar: mjälte ex-vivo, T-cellsberikad fraktion, iNKT positiv fraktion och iNKT-negativ fraktion. Färga cellerna med: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC och DAPI.
OBS: Den förväntade återhämtningen från en iVα14-Jα18 mus är 2x106 iNKT-celler .
4. aktivering och expansion av iNKT-celler
- Aktivera renade iNKT-celler med mus T-aktivator anti-CD3/CD28 magnetiska pärlor i ett 1:1-förhållande.
- Centrifugera den iNKT-cellens positiva fraktion vid 300 x g i 5 minuter.
- Överför under tiden lämplig volym anti-CD3/ CD28 magnetiska pärlor till ett rör och tillsätt en lika stor volym PBS, virvel i 5 sekunder. Placera röret på en magnet i 1 minut och kassera supernatanten.
- Ta bort röret från magneten och återanvänd de tvättade magnetiska pärlorna i rätt volym av komplett RPMI (RPMI 1640 medium, 10% värmeinaktiverad FCS, 1 mM natrium pyruvat, 1% Icke-essentiella aminosyror, 10 U /ml penicyllin och streptomycin, 50 μM β-Mercaptoethanol) för att ha 5 x 105 iNKT-celler. Använd denna suspension för att återanvända den centrifugerade iNKT-positiva fraktionen.
- Platta 1 ml av cellfjädringen (5 x 105 iNKT-celler) och anti-CD3/CD28 magnetiska pärlor i en 48 brunnsplatta med 20 U/ml IL-2 och inkubera vid 37 °C.
- Efter 5 dagar, tillsätt 10 ng/mL IL-7.
- Dela cellerna 1:2 när de når 80-90% sammanflöde, tillsätt alltid 20U / mL IL-2 och 10 ng / mL IL-7. Under dessa förhållanden kan iNKT-celler expanderas i upp till 15 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet som beskrivs i detta manuskript gör det möjligt att berika iNKT-celler från mjälten av iVa14-Ja18 transgena möss genom en immunomagnetisk separationsprocess sammanfattad i figur 1A. Totala mjälte T-celler väljs först negativt genom uttömning av B-celler och monocyter, följt av iNKT-cellspositiv immunomagnetisk sortering med PBS-57 lipidantigen laddade CD1d-tetramerer, som gör det möjligt att specifikt färga endast iNKT-celler. Detta protokoll ger ca 2 x 106 av 95-98% rena iNKT-celler från mjälten på en enda iVa14-Ja18 Tg-mus. Inga eller riktigt få iNKT-celler kan detekteras i den negativa fraktionen (bild 1B).
Efter berikning kan iVa14 iNKT-celler utökas med anti-CD3/CD28 pärlor plus IL-2 och IL-7 (figur 2A), vilket resulterar i 30-faldig expansion i genomsnitt på dag +14 av kulturen som visas i figur 2B.
Figur 3A visar iNKT-cellsrenhet tillsammans med expansionen in vitro och uttrycket av CD4-molekylen. Vi observerade en minskning av andelen TCRβ+ CD1d-tetramer+ dubbla positiva celler: den starka aktiveringen med anti-CD3/CD28 pärlor inducerar nedregleringen av iNKT cell TCR uttryck på cellytan, och en dubbel negativ population visas. Majoriteten av de expanderadeiNKT-cellernavar CD4 - . Figur 3B visar en karakterisering av uttrycket av härstamningsspecifika transkriptionsfaktorer PLZF och RORγt på berikade iNKT-celler dag 0 och 14 dagar efter expansionen. Denna färgning gör det möjligt att identifiera NKT1 (PLZFlåg RORγt-), NKT2 (PLZFhög RORγt-) och NKT17 (PLZFint RORγt+) fenotyper. Som mestadels NKT1 och NKT2 visar de berikade iNKT-cellerna en TH0-liknande effektorfenotyp. Denna fenotyp bevaras efter 14 dagars expansion, vilket bekräftas av utsöndringen av både IFN-γ och IL-4 efter PMA/Ionomycin stimulering som visas i figur 3C.
Bild 1: iNKT-cellberikning. A) Schematisk representation av det immunmagnetiska separationsprotokollet. B) Flödescytometrianalys av varje anrikningssteg. Procentandel av T-cellfrekvenser visas i de övre tomterna, gated på livskraftiga lymfocyter. Medan procentandelen iNKT-cellfrekvenser längs varje steg visas i de nedre tomterna, gated på livskraftiga CD19- TCRβ+ lymfocyter. Färgning på livskraftig CD19- TCRβ+ lymfocyter med oladdad CD1d tetramer gör det möjligt att korrekt rita iNKT-cellporten. Ett representativt experiment visas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: iNKT-cellin vitro-expansion. A) iNKT-cell räknas längs iNKT-cellexpansion. Tre representativa och oberoende experiment visas. B) Vik ökning av iNKT-cellnummer dag 7 och 14 efter rening och aktivering. Medel ± SD visas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Utökad iNKT-celltecken. A) Flödescytometrianalys av iNKT-cellprocent och CD4-uttryck under expansionsperioden. Övre tomter är gated på livskraftiga lymfocyter. Lägre tomter är gated på iNKT-celler (livskraftig CD1d-tetramer+ TCRβ+ lymfocyter). B) Fenotypisk karakterisering av berikade (dag 0) och expanderade (dag 14) iNKT-celler. Tomter är inhägnade på iNKT-celler (livskraftig CD1d-tetramer+ TCRβ+ lymfocyter). Cellerna var intranukleärt färgade för transkriptionsfaktorer med Foxp3 Transcription Factor Staining Buffer Set. NKT1 (PLZFlåg RORγt-), NKT2 (PLZFhög RORγt-) och NKT17 (PLZFint RORγt+) delmängder identifierades, frekvenser för varje delmängd visas i procent. C) Cytokinproduktion av expanderade iNKT-celler dag 14. Tomter är inhägnade på iNKT-celler (livskraftig CD1d-tetramer+ TCRβ+ lymfocyter). Cellerna stimulerades i 4 timmar med PMA 25 ng/mL/Ionomycin 1 μg/ml, i närvaro under de senaste 2 timmarna av Brefeldin A 10 μg/mL. Celler fixerades sedan med PFA 2%, permeabilized med Permwash och sedan intracellulärt färgade för cytokin produktion. Gating-strategin sattes på den icke-aktiverade kontrollen, vänster panel. Ett representativt experiment visas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi ett reproducerbart och genomförbart protokoll för att få miljontals färdiga iNKT-celler. På grund av bristen på dessa celler in vivo, var en metod för att expandera dem välbehövlig. Det protokoll vi föreslår kräver varken en viss instrumentering eller ett stort antal möss. Vi utnyttjade iVα14-Jα18 transgena möss med avsikt att minska antalet möss som behövs för proceduren.
Ett annat framgångsrikt protokoll för iNKT-cellexpansion från iVα14-Jα18 transgena möss finns i litteraturen10. Detta protokoll omfattar generering, 6 dagar före iNKT cellrening, av färska benmärg-härledda dendritiska celler, sedan laddas med α-galactosylceramid och bestrålad, plus IL-2 och IL-7. Vi anser att minskningen av antalet möss som är involverade i förfarandet är en stor fördel med protokollet. Det är också tidsbesparande, eftersom inrättandet av cellkulturen varar en enda dag istället för en vecka. En möjlig begränsning av reproducerbarheten av det nuvarande protokollet kan vara tillgängligheten av iVα14-Jα18 transgena möss, som dock är kommersiellt tillgängliga. I avsaknad av dessa möss förutser vi möjligheten att använda ett stort antal WT-möss, men protokollet måste ställas in i enlighet därmed på grund av bristen på iNKT-celler hos WT-möss.
Under cellkulturen kontrollerar vi vanligtvis renheten och fenotypen av expanderade iNKT-celler. Minskningen av andelen TCRβ+ CD1d-tetramer+ dubbla positiva celler (figur 3A) kan förklaras av en naturlig nedreglering av den invarianta NKT-cell-TCR från cellytan efter aktivering. Dessutom uttryckte majoriteten av de expanderade iNKT-cellerna inte CD4 (figur 3A):detta kan utgöra en fördel i samband med en adoptivcellsterapi, eftersom CD4 - iNKT-celler befanns vara de mest effektiva för att kontrollera tumörprogression11. Dessutom är den observerade TH0-liknande effektorfenotypen (figur 3C) helt sammanhängande med den som observerats i mänskliga iNKT-celler efter in vitro-expansion och restimulering8,12,13,14,15. De expanderade cellerna är mycket reaktiva in vivo och in vitro, vilket är användbara i samband med iNKT cellbaserade adoptivimmunterapier. Adoptivöverföring av ohanterliga eller expanderade iNKT-celler förhindrar eller lindrar akut graft- versus- host disease (aGVHD) och lämnar oförändrad Graft- Versus-Leukemi-effekten16,17,18,19. Adoptivt överförd mänsklig iNKT-celler expanderad in vitro med αGal-Cer lindra xenogeneic aGVHD och denna effekt förmedlas av CD4- men inte CD4+ celler20. Med tanke på att iNKT-celler inte orsakar aGVHD utgör de dessutom de idealiska cellerna för CAR-immunterapi utan behov av borttagning av deras TCR och visade sig ha långvarig antitumöraktivitet in vivo8,15. iNKT-celler utnyttjas för närvarande i pågående och avslutade kliniska prövningar21,22,23,24.
Sammanfattningsvis är det beskrivna protokollet snabbt, enkelt och möjliggör en 30x ökning av antalet iNKT-celler som återställs från en mus mjälte (figur 3B). Dessa celler kan lätt utnyttjas för in vitro erkännande analyser, samkultursystem eller adoptiv cell terapi i prekliniska studier. iNKT-celler spelar verkligen en avgörande roll i tumör immunövervakning, infektionssjukdomar och autoimmunitet. I dessa sammanhang kan iNKT-celler representera ett kraftfullt verktyg, vilket är ett tilltalande alternativ till konventionella T-celler som saknar MHC-begränsningen. Den snabba genereringen av stora mängder av dessa celler och möjligheten att ytterligare manipulera dem in vitro kan leda till utvecklingen av oöverträffade terapeutiska strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Paolo Dellabona och Giulia Casorati för vetenskapligt stöd och kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar också NIH Tetramer Core Facility för mus CD1d tetramer. Studien finansierades av Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (till M.F.) och Italian Association for Cancer Research (AIRC) fellowship 2019-22604 (till G.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
- Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
- Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
- Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
- Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
- Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
- Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
- Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
- de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
- Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
- Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
- Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
- Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
- Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
- Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
- Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
- Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
- Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
- Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
- Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
- Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).
