يقدم هذا البروتوكول طريقة للثقافة ونمو 3D للخلايا الشبيهة بالأرومة المينائية في الجاذبية الصغرى للحفاظ على شكلها الممدود والمستقطب بالإضافة إلى تعبير البروتين الخاص بالمينا. كما يتم وصف ظروف الثقافة لثقافة التركيبات الهندسية للثة وأعضاء الرئة في الجاذبية الصغرى.
الجاذبية هي واحدة من المحددات الرئيسية لوظيفة الخلية البشرية ، والانتشار ، والبنية الهيكلية الخلوية والتوجه. تحاكي أنظمة المفاعلات الحيوية الدوارة (RCCSs) فقدان الجاذبية عند حدوثه في الفضاء وتوفر بدلا من ذلك بيئة الجاذبية الصغرى من خلال الدوران المستمر للخلايا أو الأنسجة المستزرعة. تضمن هذه RCCSs إمدادا غير منقطع من العناصر الغذائية وعوامل النمو والنسخ والأكسجين ، وتعالج بعض أوجه القصور في قوى الجاذبية في أطباق زراعة الخلايا أو الأعضاء 2D (ثنائية الأبعاد) بلا حراك. في الدراسة الحالية ، استخدمنا RCCSs لمشاركة خلايا حلقة عنق الرحم وخلايا لب الأسنان لتصبح أرومات مينائية ، لتوصيف تفاعلات السلف / السقالة اللثوية ، ولتحديد تأثير الالتهاب على الحويصلات الهوائية الرئوية. سهلت بيئات RCCS نمو الخلايا الشبيهة بالأرومات المينائية ، وعززت تكاثر السلف اللثوي استجابة لطلاء السقالات ، وسمحت بتقييم آثار التغيرات الالتهابية على الحويصلات الهوائية الرئوية المزروعة. تلخص هذه المخطوطة الظروف البيئية والمواد والخطوات على طول الطريق وتسلط الضوء على الجوانب الهامة والتفاصيل التجريبية. في الختام ، RCCSs هي أدوات مبتكرة لإتقان الثقافة والنمو ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) للخلايا في المختبر والسماح بدراسة الأنظمة الخلوية أو التفاعلات غير القابلة لبيئات ثقافة 2D الكلاسيكية.
تؤثر الجاذبية على جميع جوانب الحياة على الأرض ، بما في ذلك بيولوجيا الخلايا الفردية ووظيفتها داخل الكائنات الحية. تستشعر الخلايا الجاذبية من خلال المستقبلات الميكانيكية وتستجيب للتغيرات في الجاذبية عن طريق إعادة تكوين البنى الهيكلية الخلوية وتغيير انقسام الخلايا1،2،3. تشمل التأثيرات الأخرى للجاذبية الصغرى الضغط الهيدروستاتيكي في الحويصلات المملوءة بالسوائل ، وترسيب العضيات ، والحمل الحراري المدفوع بالطفو للتدفق والحرارة4. أجريت دراسات حول تأثير فقدان الجاذبية على الخلايا والأعضاء البشرية في الأصل لمحاكاة بيئة الفضاء عديمة الوزن على رواد الفضاء أثناء بعثات الرحلات الفضائية5. ومع ذلك ، في السنوات الأخيرة ، أصبحت تقنيات المفاعلات الحيوية ثلاثية الأبعاد هذه التي طورتها ناسا في الأصل لمحاكاة الجاذبية الصغرى ذات أهمية متزايدة كنهج جديدة لثقافة مجموعات الخلايا التي لا تكون قابلة لأنظمة الثقافة 2D.
تحاكي المفاعلات الحيوية 3D الجاذبية الصغرى عن طريق نمو الخلايا المعلقة وبالتالي خلق تأثير “السقوط الحر” المستمر. تشمل المزايا الأخرى للمفاعلات الحيوية الدوارة عدم التعرض للهواء الذي تصادفه أنظمة زراعة الأعضاء ، وتقليل إجهاد القص والاضطراب ، والتعرض المستمر لإمدادات متغيرة من العناصر الغذائية. هذه الظروف الديناميكية التي يوفرها المفاعل الحيوي لنظام زراعة الخلايا الدوارة (RCCS) تفضل التوطين المكاني المشترك والتجميع ثلاثي الأبعاد للخلايا المفردة في مجاميع 6,7.
أظهرت الدراسات السابقة مزايا المفاعل الحيوي الدوار لتجديد العظام8 ، وزراعة جرثومة الأسنان9 ، ولزراعة خلايا بصيلات الأسنان البشرية10. كان هناك أيضا تقرير يشير إلى أن RCCS يعزز تكاثر خلايا EOE والتمايز إلى الأرومات المينائية11. ومع ذلك ، تم اعتبار الخلايا المتمايزة أرومات مينائية بناء على التألق المناعي للأميلوبلاستين و / أو تعبير الأميلوجينين وحده11 دون النظر في مورفولوجيتها الممدودة أو شكل الخلية المستقطبة.
بالإضافة إلى المفاعل الحيوي لأوعية الجدار الدوار (RWV) الذي طورته وكالة ناسا ، تشمل التقنيات الأخرى لتوليد مجاميع 3D من الخلايا الرفع المغناطيسي ، وآلة تحديد المواقع العشوائية (RPM) و clinostat12. لتحقيق الرفع المغناطيسي ، يتم رفع الخلايا الموسومة بجسيمات نانوية مغناطيسية باستخدام قوة مغناطيسية خارجية ، مما يؤدي إلى تكوين هياكل ثلاثية الأبعاد خالية من السقالات تم استخدامها للتصنيع الحيوي لهياكل الخلايا الشحمية13،14،15. هناك طريقة أخرى لمحاكاة الجاذبية الصغرى وهي توليد قوى G متعددة الاتجاهات عن طريق التحكم في الدوران المتزامن حول محورين مما يؤدي إلى إلغاء متجه الجاذبية التراكمي في مركز جهاز يسمى clinostat16. عندما تم استزراع الخلايا الجذعية لنخاع العظم في كلينستات ، تم تثبيط تكوين عظام جديدة من خلال قمع تمايز بانيات العظم ، مما يوضح أحد التأثيرات غير المتمايزة للجاذبية الصغرى16.
من شأن الأنظمة المختبرية لتسهيل الثقافة المخلصة للأرومات المينائية أن توفر خطوة كبيرة إلى الأمام نحو هندسة أنسجة مينا الأسنان17. لسوء الحظ ، حتى هذا التاريخ ، كانت ثقافة الأرومات المينائية مهمة صعبة18,19. حتى الآن ، تم الإبلاغ عن خمسة خطوط خلايا مختلفة تشبه الأرومة المينائية ، بما في ذلك خط خلية سلالة الأرومة المينائية للفأر (ALC) ، وخط الخلايا الظهارية لأسنان الفئران (HAT-7) ، وخط خلية الفأر LS8 20 ، وخط خلية PABSo-E الخنازير21 وخط خلية الفئران SF2-2422. ومع ذلك ، فقد فقدت غالبية هذه الخلايا شكل الخلية المستقطبة المميزة في ثقافة 2D.
في هذه الدراسة ، لجأنا إلى نظام المفاعل الحيوي لثقافة الخلايا الدوارة (RCCS) لتسهيل نمو الخلايا الشبيهة بالأرومة المينائية من ظهارة عنق الرحم المستزرعة بالاشتراك مع أسلاف اللحمة المتوسطة وللتغلب على تحديات أنظمة الاستزراع 2D ، بما في ذلك انخفاض تدفق العناصر الغذائية والتغيرات الهيكلية الخلوية بسبب الجاذبية. بالإضافة إلى ذلك ، قدمت RCCS طرقا جديدة لدراسة تفاعلات الخلايا / السقالات المتعلقة بهندسة أنسجة اللثة وفحص آثار الوسطاء الالتهابيين على الأنسجة السنخية الرئوية في المختبر. وتسلط نتائج هذه الدراسات مجتمعة الضوء على فوائد نظم الاستزراع الدوار القائمة على الجاذبية الصغرى لتكاثر الظهارة المتمايزة ولتقييم الآثار البيئية على الخلايا المزروعة في المختبر، بما في ذلك تفاعلات الخلايا/السقالات واستجابة الأنسجة للحالات الالتهابية.
تشمل الخطوات الحاسمة لبروتوكول نمو الخلايا في الجاذبية الصغرى المفاعل الحيوي ، والسقالة ، والخلايا المستخدمة في ثقافة 3D ، وطلاء السقالة كوسيلة للحث على تمايز الخلايا. يتكون نوع المفاعل الحيوي المستخدم في دراساتنا من المفاعل الحيوي RCCS-4 ، وهو تعديل حديث لجهاز زراعة الأنسجة الأسطوانية الد?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم الدراسات بسخاء بمنح من المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والقحف الوجهي (UG3-DE028869 و R01-DE027930).
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
Fibronectin | Corning | 354008 | |
Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
Laminin | Corning | 354259 | |
LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
Matrigel | Corning | 354234 | |
Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |