פרוטוקול זה מציג שיטה לתרבית ולצמיחה תלת-ממדית של תאים דמויי אמלובלסט במיקרו-כבידה כדי לשמור על צורתם המוארכת והמקוטבת, כמו גם על ביטוי חלבונים ספציפיים לאמייל. כמו כן מתוארים תנאי תרבית לתרבית של מבנים הנדסיים פריודונטליים ואיברי ריאה במיקרו-כבידה.
כוח הכבידה הוא אחד הגורמים המרכזיים המשפיעים על תפקוד התא האנושי, התפשטותו, ארכיטקטורה ציטוסקטלית והתמצאות. מערכות ביוריאקטורים סיבוביים (RCCSs) מחקות את אובדן הכבידה כפי שהוא מתרחש בחלל ובמקום זאת מספקות סביבת מיקרו-כבידה באמצעות סיבוב מתמשך של תאים או רקמות בתרבית. RCCSs אלה מבטיחים אספקה ללא הפרעה של חומרים מזינים, גורמי גדילה ושעתוק וחמצן, ומטפלים בכמה מהחסרונות של כוחות הכבידה בכלים דו-ממדיים (דו-ממדיים) של תאים דו-ממדיים או של תרביות איברים ללא תנועה. במחקר הנוכחי השתמשנו ב-RCCSs כדי לתרבת תאים של לולאת צוואר הרחם ותאי מוך השן כדי להפוך לאמלובלסטים, כדי לאפיין אינטראקציות של אבות חניכיים/פיגומים, וכדי לקבוע את ההשפעה של דלקת על נאדיות ריאה. סביבות ה-RCCS הקלו על צמיחה של תאים דמויי אמלובלסט, קידמו שגשוג אבות חניכיים בתגובה לציפויי פיגומים, ואפשרו הערכה של ההשפעות של שינויים דלקתיים על נאדיות ריאה בתרבית. כתב יד זה מסכם את התנאים הסביבתיים, החומרים והצעדים לאורך הדרך ומדגיש היבטים קריטיים ופרטים ניסיוניים. לסיכום, RCCSs הם כלים חדשניים כדי לשלוט בתרבית ובצמיחה התלת-ממדית (תלת-ממדית) של תאים במבחנה ולאפשר מחקר של מערכות תאיות או אינטראקציות שאינן מקובלות על סביבות תרבית דו-ממדיות קלאסיות.
כוח הכבידה משפיע על כל היבטי החיים על פני כדור הארץ, כולל הביולוגיה של תאים בודדים ותפקודם בתוך אורגניזמים. תאים חשים את כוח הכבידה באמצעות מכנורצפטורים ומגיבים לשינויים בכוח הכבידה על ידי הגדרה מחדש של ארכיטקטורות ציטוסקטליות ועל ידי שינוי חלוקת התא 1,2,3. השפעות אחרות של מיקרו-כבידה כוללות את הלחץ ההידרוסטטי בבועיות מלאות בנוזל, שקיעה של אברונים, והסעה מונעת ציפה של זרימה וחום4. מחקרים על השפעת אובדן כוח הכבידה על תאים ואיברים אנושיים נערכו במקור כדי לדמות את הסביבה חסרת המשקל של החלל על אסטרונאוטים במהלך משימות טיסה בחלל5. עם זאת, בשנים האחרונות, טכנולוגיות הביו-ריאקטור התלת-ממדיות הללו, שפותחו במקור על ידי נאס”א כדי לדמות מיקרו-כבידה, הופכות רלוונטיות יותר ויותר כגישות חדשניות לתרבית של אוכלוסיות תאים, שאחרת אינן מקובלות על מערכות תרבית דו-ממדיות.
ביוריאקטורים תלת-ממדיים מדמים מיקרו-כבידה על-ידי גידול תאים בתרחיף ובכך יוצרים אפקט קבוע של “נפילה חופשית”. יתרונות נוספים של הביוריאקטורים המסתובבים כוללים את היעדר החשיפה לאוויר במערכות תרבית איברים, הפחתה בלחץ הגזירה ובמערבולות, וחשיפה מתמשכת לאספקה משתנה של חומרי מזון. תנאים דינמיים אלה המסופקים על ידי ביוריאקטור של מערכת תרביות תאים סיבובית (RCCS) מעדיפים לוקליזציה של קו-לוקליזציה מרחבית והרכבה תלת-ממדית של תאים בודדים לתוך אגרגטים 6,7.
מחקרים קודמים הדגימו את היתרונות של ביוריאקטור סיבובי להתחדשות עצם8, תרבית נבט שיניים9, ולתרבית של תאי זקיק דנטלייםאנושיים 10. כמו כן, פורסם דו”ח המצביע על כך ש-RCCS מגביר את התפשטות תאי ה-EOE ואת התמיינותם לאמלובלסטים11. עם זאת, תאים ממוינים נחשבו לאמלובלסטים המבוססים על אימונופלואורסצנציה של אמלובלסטין ו/או ביטוי אמלוגנין בלבד11 מבלי לקחת בחשבון את המורפולוגיה המוארכת שלהם או את צורת התא המקוטבת שלהם.
בנוסף לביוריאקטור של כלי קיר מסתובבים (RWV) שפותח על ידי נאס”א, טכנולוגיות אחרות ליצירת אגרגטים תלת-ממדיים מתאים כוללות ריחוף מגנטי, מכונת המיקום האקראית (RPM) והקלינוסטט12. כדי להשיג ריחוף מגנטי, תאים המסומנים בננו-חלקיקים מגנטיים מרחפים באמצעות כוח מגנטי חיצוני, וכתוצאה מכך נוצרים מבנים תלת-ממדיים נטולי פיגומים ששימשו לייצור ביולוגי של מבנים אדיפוציטים13,14,15. גישה נוספת להדמיית מיקרו-כבידה היא יצירת כוחות G רב-כיווניים על ידי שליטה בסיבוב סימולטני על שני צירים וכתוצאה מכך ביטול וקטור הכבידה המצטבר במרכז התקן הנקרא קלינוסטט16. כאשר תאי גזע של מח עצם גודלו בתרבית בקלינוסטט, היווצרות עצם חדשה עוכבה באמצעות דיכוי התמיינות אוסטאובלסט, מה שממחיש את אחת ההשפעות המפרישות של מיקרו-כבידה16.
מערכות במבחנה כדי להקל על התרבות הנאמנה של אמלובלסטים יספקו צעד גדול קדימה לקראת הנדסת רקמת אמייל השן17. למרבה הצער, עד כה, תרבות האמלובלסטים הייתה משימה מאתגרת18,19. עד כה דווח על חמישה קווי תאים שונים דמויי אמלובלסטים, כולל קו תאי שושלת האמלובלסטים של העכבר (ALC), קו תאי האפיתל הדנטלי של החולדה (HAT-7), קו תאי LS8 של העכבר20, קו התאים PABSo-E החזירי 21 וקו התאים SF2-24 של החולדה22. עם זאת, רוב התאים האלה איבדו את צורת התא המקוטבת הייחודית שלהם בתרבית דו-ממדית.
במחקר הנוכחי פנינו למערכת ביוריאקטורים של תרבית תאים סיבוביים (RCCS) כדי להקל על צמיחתם של תאים דמויי אמלובלסט מאפיתליה של לולאת צוואר הרחם בתרבית משותפת עם אבות מזנכימליים ולהתגבר על האתגרים של מערכות תרבית דו-ממדיות, כולל זרימה מופחתת של חומרים מזינים ושינויים ציטוסקטליים עקב כוח הכבידה. בנוסף, ה-RCCS סיפק אפיקים חדשניים לחקר אינטראקציות בין תאים לפיגומים הקשורים להנדסת רקמות חניכיים ולבחינת ההשפעות של מתווכי דלקת על רקמות נאדיות ריאה במבחנה. יחד, תוצאות מחקרים אלה מדגישות את היתרונות של מערכות תרבית סיבוביות מבוססות מיקרו-כבידה להפצת אפיתליה מובחנת ולהערכת השפעות סביבתיות על תאים הגדלים במבחנה, כולל אינטראקציות בין תאים לפיגומים ותגובת הרקמות למצבים דלקתיים.
שלבים קריטיים בפרוטוקול לצמיחת תאים במיקרו-כבידה כוללים את הביוריאקטור, הפיגום, התאים המשמשים לתרבית תלת-ממדית וציפוי הפיגומים כאמצעי להשראת התמיינות תאים. סוג הביוריאקטור המשמש במחקרים שלנו כולל את הביוריאקטור RCCS-4, שינוי שנערך לאחרונה במערכת תרבית התאים הסיבובית המקורית (RCCS) של מתקן תר…
The authors have nothing to disclose.
המחקרים נתמכו בנדיבות על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניופציאלי (UG3-DE028869 ו-R01-DE027930).
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
Fibronectin | Corning | 354008 | |
Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
Laminin | Corning | 354259 | |
LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
Matrigel | Corning | 354234 | |
Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |