Propagazione di cellule e organi dentali e respiratori in microgravità

Summary

Questo protocollo presenta un metodo per la coltura e la crescita 3D di cellule simili agli ameloblasti in microgravità per mantenere la loro forma allungata e polarizzata e l’espressione proteica specifica dello smalto. Sono inoltre descritte le condizioni di coltura per la coltura dei costrutti di ingegneria parodontale e degli organi polmonari in microgravità.

Abstract

La gravità è uno dei determinanti chiave della funzione delle cellule umane, della proliferazione, dell’architettura citoscheletrica e dell’orientamento. I sistemi di bioreattori rotanti (RCCS) imitano la perdita di gravità che si verifica nello spazio e forniscono invece un ambiente di microgravità attraverso la rotazione continua di cellule o tessuti in coltura. Questi RCCS assicurano un apporto ininterrotto di nutrienti, fattori di crescita e trascrizione e ossigeno e affrontano alcune delle carenze delle forze gravitazionali in piatti immobili di coltura cellulare o di organi 2D (bidimensionali). Nel presente studio abbiamo utilizzato RCCS per co-coltivare cellule dell’ansa cervicale e cellule della polpa dentale per diventare ameloblasti, per caratterizzare le interazioni progenitore/scaffold parodontale e per determinare l’effetto dell’infiammazione sugli alveoli polmonari. Gli ambienti RCCS hanno facilitato la crescita di cellule simili agli ameloblasti, promosso la proliferazione dei progenitori parodontali in risposta ai rivestimenti dell’impalcatura e hanno permesso una valutazione degli effetti dei cambiamenti infiammatori sugli alveoli polmonari coltivati. Questo manoscritto riassume le condizioni ambientali, i materiali e le fasi lungo il percorso ed evidenzia aspetti critici e dettagli sperimentali. In conclusione, gli RCCS sono strumenti innovativi per padroneggiare la coltura e la crescita 3D (tridimensionale) di cellule in vitro e per consentire lo studio di sistemi cellulari o interazioni non suscettibili di classici ambienti di coltura 2D.

Introduction

La gravità influenza tutti gli aspetti della vita sulla Terra, compresa la biologia delle singole cellule e la loro funzione all’interno degli organismi. Le cellule percepiscono la gravità attraverso i meccanorecettori e rispondono ai cambiamenti di gravità riconfigurando le architetture citoscheletriche e alterando la divisione cellulare ^1,2,3. Altri effetti della microgravità includono la pressione idrostatica nelle vescicole piene di liquido, la sedimentazione degli organelli e la convezione guidata dalla galleggiabilità del flusso e del calore⁴. Gli studi sull’effetto della perdita di gravità sulle cellule e sugli organi umani sono stati originariamente condotti per simulare l’ambiente senza peso dello spazio sugli astronauti durante le missioni di volo spaziale⁵. Tuttavia, negli ultimi anni, queste tecnologie di bioreattori 3D originariamente sviluppate dalla NASA per simulare la microgravità stanno diventando sempre più rilevanti come nuovi approcci per la coltura di popolazioni cellulari che altrimenti non sarebbero suscettibili di sistemi di coltura 2D.

I bioreattori 3D simulano la microgravità facendo crescere cellule in sospensione e creando così un costante effetto di “caduta libera”. Altri vantaggi dei bioreattori rotanti includono la mancanza di esposizione all’aria riscontrata nei sistemi di coltura degli organi, una riduzione dello stress di taglio e della turbolenza e una continua esposizione a un cambiamento dell’apporto di sostanze nutritive. Queste condizioni dinamiche fornite da un bioreattore Rotary Cell Culture System (RCCS) favoriscono la co-localizzazione spaziale e l’assemblaggio tridimensionale di singole cellule in aggregati ^6,7.

Studi precedenti hanno dimostrato i vantaggi di un bioreattore rotativo per la rigenerazione ossea⁸, la coltura di germi dentali⁹ e per la coltura di cellule follicolari dentali umane¹⁰. C’è stato anche un rapporto che suggerisce che RCCS migliora la proliferazione delle cellule EOE e la differenziazione in ameloblasti¹¹. Tuttavia, le cellule differenziate sono state considerate ameloblasti sulla base dell’immunofluorescenza dell’ameloblastina e/o dell’espressione di amelogenina da sola¹¹ senza considerare la loro morfologia allungata o la forma cellulare polarizzata.

Oltre al bioreattore RWV (rotating wall vessels) sviluppato dalla NASA, altre tecnologie per generare aggregati 3D dalle cellule includono la levitazione magnetica, la macchina di posizionamento casuale (RPM) e il clinostato¹². Per ottenere la levitazione magnetica, le cellule marcate con nanoparticelle magnetiche vengono levitate utilizzando una forza magnetica esterna, con conseguente formazione di strutture 3D prive di impalcature che sono state utilizzate per la biofabbricazione di strutture adipocitarie^13,14,15. Un altro approccio per simulare la microgravità è la generazione di forze G multidirezionali controllando la rotazione simultanea su due assi con conseguente cancellazione del vettore di gravità cumulativo al centro di un dispositivo chiamato clinostat¹⁶. Quando le cellule staminali del midollo osseo sono state coltivate in un clinostat, la formazione di nuovo osso è stata inibita attraverso la soppressione della differenziazione degli osteoblasti, illustrando uno degli effetti dedifferenzianti della microgravità¹⁶.

I sistemi in vitro per facilitare la coltura fedele degli ameloblasti fornirebbero un importante passo avanti verso l’ingegneria dei tessuti dello smalto dei denti¹⁷. Sfortunatamente, fino ad oggi, la cultura degli ameloblasti è stata un’impresa impegnativa^18,19. Finora, sono state descritte cinque diverse linee cellulari simili agli ameloblasti, tra cui la linea cellulare di ameloblasti di topo (ALC), la linea cellulare epiteliale dentale del ratto (HAT-7), la linea cellulare LS8 del topo²⁰, la linea cellulare PABSo-E suina 21 e la linea cellulare SF2-24 del ratto²². Tuttavia, la maggior parte di queste cellule ha perso la loro caratteristica forma cellulare polarizzata nella coltura 2D.

Nel presente studio ci siamo rivolti a un sistema di bioreattore di coltura cellulare rotante (RCCS) per facilitare la crescita di cellule simili agli ameloblasti da epiteli dell’ansa cervicale co-coltivati con progenitori mesenchimali e per superare le sfide dei sistemi di coltura 2D, tra cui il ridotto flusso di nutrienti e i cambiamenti citoscheletrici dovuti alla gravità. Inoltre, l’RCCS ha fornito nuove strade per lo studio delle interazioni cellula/scaffold relative all’ingegneria del tessuto parodontale e per esaminare gli effetti dei mediatori infiammatori sui tessuti alveolari polmonari in vitro. Insieme, i risultati di questi studi evidenziano i benefici dei sistemi di coltura rotativa basati sulla microgravità per la propagazione di epiteli differenziati e per la valutazione degli effetti ambientali sulle cellule coltivate in vitro, comprese le interazioni cellula/scaffold e la risposta tissutale alle condizioni infiammatorie.

Protocol

È stata ottenuta tutta l’approvazione istituzionale necessaria per garantire che lo studio fosse conforme alle linee guida istituzionali per la cura degli animali TAMU. 1. Assemblaggio e sterilizzazione del bioreattore Sterilizzare quattro recipienti ad alto rapporto d’aspetto (HARV) per il bioreattore in autoclave sul ciclo dello strumento in plastica per 20 minuti a 121 °C come raccomandato dal produttore. Dopo la sterilizzazione, assemblare i vasi in una cappa di coltu…

Representative Results

La camera interna del bioreattore fornisce un ambiente in cui le cellule possono proliferare e differenziarsi, attaccarsi a un’impalcatura o riunirsi per formare tessuti come assemblaggi. Ogni vaso HARV contiene fino a 10 ml di terreno e facilita una circolazione costante di sostanze nutritive in modo che ogni cellula abbia un’eccellente possibilità di sopravvivere. La figura 1A illustra il fissaggio delle porte della siringa alla piastra anteriore del recipiente in cui sono fissate le valv…

Discussion

I passaggi critici del protocollo per la crescita delle cellule in microgravità includono il bioreattore, lo scaffold, le cellule utilizzate per la coltura 3D e il rivestimento dello scaffold come mezzo per indurre la differenziazione cellulare. Il tipo di bioreattore utilizzato nei nostri studi comprende il bioreattore RCCS-4, una recente modifica dell’originale dispositivo di coltura cilindrica rotante del sistema di coltura cellulare rotante (RCCS) sviluppato dalla NASA per far crescere cellule in microgravità simul…

Materials

Antibiotic-antimycotic	ThermoFisher Scientfic	15240096
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4544
BGJb Fitton-Jackson Modification media	ThermoFisher Scientfic	12591
BIOST PGA scaffold	Synthecon	Custom	Available from the company through a custom order
BMP-2	R&D Systems	355-BM
BMP-4	R&D Systems	314-BP
DMEM Media	Sigma Aldrich	D6429-500mL
FBS	ThermoFisher Scientfic	16140071
Fibricol	Advanced Biomatrix	5133-20mL
Fibronectin	Corning	354008
Galanin	Sigma Aldrich	G-0278
Gelatin disc	Advanced Biomatrix	CytoForm 500
Graphene sheets	Advanced Biomatrix	CytoForm 300
hEGF	Peprotech	AF-100-15
hFGF	ThermoFisher Scientfic	AA1-155
Hydroxyapatite disc	Advanced Biomatrix	CytoForm 200
Il-6 protein	PeproTech	200-06
Keratinocyte SFM media (1X)	ThermoFisher Scientfic	17005042
Laminin	Corning	354259
LRAP peptide	Peptide 2.0	Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD
Matrigel	Corning	354234
Millipore Nitrocellulose membrane	Merck Millipore	AABP04700
RCCS Bioreactor	Synthecon	RCCS 4HD
SpongeCol	Advanced Biomatrix	5135-25EA
Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock	Smiths Medical	MX5-61L
Syringes with needle 3cc	McKESSON	16-SN3C211
Trypsin EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientfic	25200056