Vermehrung von Zahn- und Atmungszellen und -organen in Schwerelosigkeit

Summary

Dieses Protokoll stellt eine Methode für die Kultur und das 3D-Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen in Schwerelosigkeit vor, um ihre längliche und polarisierte Form sowie die schmelzspezifische Proteinexpression zu erhalten. Auch Kulturbedingungen für die Kultur von parodontalen Engineering-Konstrukten und Lungenorganen in Schwerelosigkeit werden beschrieben.

Abstract

Die Schwerkraft ist eine der Schlüsseldeterminanten der menschlichen Zellfunktion, Proliferation, Zytoskelettarchitektur und Orientierung. Rotationsbioreaktorsysteme (RCCSs) ahmen den Verlust der Schwerkraft nach, wie er im Weltraum auftritt, und bieten stattdessen eine Mikrogravitationsumgebung durch kontinuierliche Rotation von kultivierten Zellen oder Geweben. Diese RCCSs gewährleisten eine ununterbrochene Versorgung mit Nährstoffen, Wachstums- und Transkriptionsfaktoren sowie Sauerstoff und beheben einige der Mängel der Gravitationskräfte in bewegungslosen 2D-Zell- oder Organkulturschalen. In der vorliegenden Studie haben wir RCCSs verwendet, um zervikale Schleifenzellen und Zahnpulpazellen zu Ameloblasten zu kokulturieren, parodontale Vorläufer-Gerüst-Interaktionen zu charakterisieren und die Wirkung von Entzündungen auf Lungenbläschen zu bestimmen. Die RCCS-Umgebungen erleichterten das Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen, förderten die parodontale Vorläuferproliferation als Reaktion auf Gerüstbeschichtungen und ermöglichten eine Bewertung der Auswirkungen entzündlicher Veränderungen auf kultivierte Lungenbläschen. Dieses Manuskript fasst die Umweltbedingungen, Materialien und Schritte auf dem Weg zusammen und hebt kritische Aspekte und experimentelle Details hervor. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass RCCSs innovative Werkzeuge sind, um die Kultur und das (dreidimensionale) 3D-Wachstum von Zellen in vitro zu beherrschen und die Untersuchung zellulärer Systeme oder Interaktionen zu ermöglichen, die klassischen 2D-Kulturumgebungen nicht zugänglich sind.

Introduction

Die Schwerkraft beeinflusst alle Aspekte des Lebens auf der Erde, einschließlich der Biologie einzelner Zellen und ihrer Funktion innerhalb von Organismen. Zellen spüren die Schwerkraft durch Mechanorezeptoren und reagieren auf Änderungen der Schwerkraft, indem sie Zytoskelettarchitekturen neu konfigurieren und die Zellteilung^{verändern 1,2,3}. Weitere Effekte der Schwerelosigkeit sind der hydrostatische Druck in flüssigkeitsgefüllten Vesikel, die Sedimentation von Organellen und die auftriebsgetriebene Konvektion von Strömung und Wärme⁴. Studien über die Auswirkungen des Gewichtsverlusts auf menschliche Zellen und Organe wurden ursprünglich durchgeführt, um die schwerelose Umgebung des Weltraums auf Astronauten während Raumflugmissionen zu simulieren⁵. In den letzten Jahren werden diese ursprünglich von der NASA entwickelten 3D-Bioreaktortechnologien zur Simulation der Schwerelosigkeit jedoch als neuartige Ansätze für die Kultur von Zellpopulationen, die sonst nicht für 2D-Kultursysteme zugänglich sind, immer relevanter.

3D-Bioreaktoren simulieren die Schwerelosigkeit, indem sie Zellen in Suspension züchten und so einen konstanten “Freifall”-Effekt erzeugen. Weitere Vorteile der rotierenden Bioreaktoren sind die fehlende Luftexposition in Organkultursystemen, eine Verringerung von Scherspannungen und Turbulenzen sowie eine kontinuierliche Exposition gegenüber einer sich ändernden Nährstoffversorgung. Diese dynamischen Bedingungen, die von einem Rotary Cell Culture System (RCCS) Bioreaktor bereitgestellt werden, begünstigen die räumliche Kolokalisierung und dreidimensionale Assemblierung einzelner Zellen zu Aggregaten ^6,7.

Frühere Studien haben die Vorteile eines rotierenden Bioreaktors für die Knochenregeneration⁸, Zahnkeimkultur⁹ und für die Kultur menschlicher Zahnfollikelzellen¹⁰ gezeigt. Es gibt auch einen Bericht, der darauf hindeutet, dass RCCS die Proliferation und Differenzierung von EOE-Zellen in Ameloblasten verbessert¹¹. Differenzierte Zellen wurden jedoch als Ameloblasten betrachtet, die auf Ameloblastin-Immunfluoreszenz und/oder Amelogenin-Expression allein¹¹ basierten, ohne ihre längliche Morphologie oder polarisierte Zellform zu berücksichtigen.

Neben dem von der NASA entwickelten Bioreaktor Rotating Wall Vessels (RWV) gehören zu den weiteren Technologien zur Erzeugung von 3D-Aggregaten aus Zellen die Magnetschwebebahn, die Zufallspositioniermaschine (RPM) und der Klinostat¹². Um eine Magnetschwebebahn zu erreichen, werden Zellen, die mit magnetischen Nanopartikeln markiert sind, mit einer externen Magnetkraft schweben, was zur Bildung von gerüstfreien 3D-Strukturen führt, die für die Biofabrikation von Adipozytenstrukturen verwendet wurden^13,14,15. Ein weiterer Ansatz zur Simulation der Schwerelosigkeit ist die Erzeugung multidirektionaler G-Kräfte durch Steuerung der gleichzeitigen Rotation um zwei Achsen, was zu einer Aufhebung des kumulativen Schwerevektors im Zentrum eines Geräts namens Clinostat¹⁶ führt. Wenn Knochenmarkstammzellen in einem Klinostat kultiviert wurden, wurde die Knochenneubildung durch die Unterdrückung der Osteoblastendifferenzierung gehemmt, was eine der dedifferenzierenden Effekte der Mikrogravitation veranschaulicht¹⁶.

In-vitro-Systeme, die die getreue Kultur von Ameloblasten erleichtern, würden einen großen Schritt in Richtung Zahnschmelz-Tissue Engineering darstellen¹⁷. Leider war die Kultur der Ameloblasten bis heute ein herausforderndes Unterfangen^18,19. Bisher wurden fünf verschiedene Ameloblasten-ähnliche Zelllinien beschrieben, darunter die Maus-Ameloblasten-Linien-Zelllinie (ALC), die Ratten-Zahnepithelzelllinie (HAT-7), die Maus-LS8-Zelllinie²⁰, die porcine PABSo-E-Zelllinie 21 und die Ratten-SF2-24-Zelllinie²². Die Mehrheit dieser Zellen hat jedoch ihre charakteristische polarisierte Zellform in 2D-Kultur verloren.

In der vorliegenden Studie haben wir uns einem Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) zugewandt, um das Wachstum von Ameloblasten-ähnlichen Zellen aus zervikalen Schleifenepithelien zu erleichtern, die mit mesenchymalen Vorläuferzellen kokultiviert wurden, und um die Herausforderungen von 2D-Kultursystemen zu überwinden, einschließlich reduziertem Nährstofffluss und zytoskelettalen Veränderungen aufgrund der Schwerkraft. Darüber hinaus hat das RCCS neue Wege für die Untersuchung von Zell-Gerüst-Interaktionen im Zusammenhang mit parodontalen Tissue Engineering und zur Untersuchung der Auswirkungen von Entzündungsmediatoren auf Lungenalveolargewebe in vitro eröffnet. Zusammen unterstreichen die Ergebnisse dieser Studien die Vorteile von Mikrogravitations-basierten rotatorischen Kultursystemen für die Ausbreitung differenzierter Epithelien und für die Bewertung von Umweltauswirkungen auf in vitro gezüchtete Zellen, einschließlich Zell-Gerüst-Interaktionen und der Gewebereaktion auf entzündliche Zustände.

Protocol

Es wurden alle erforderlichen institutionellen Genehmigungen eingeholt, um sicherzustellen, dass die Studie den TAMU-Richtlinien für die institutionelle Tierhaltung entspricht. 1. Aufbau und Sterilisation von Bioreaktoren Sterilisieren Sie vier Gefäße mit hohem Aspektverhältnis (HARV) für den Bioreaktor in einem Autoklaven im Kunststoff-Instrumentenzyklus für 20 Minuten bei 121 °C, wie vom Hersteller empfohlen. Nach der Sterilisation montieren Sie die Gefäße in ein…

Representative Results

Die innere Kammer des Bioreaktors bietet eine Umgebung für die Zellen, um sich zu vermehren und zu differenzieren, sich an einem Gerüst zu befestigen oder sich zu versammeln, um gewebeähnliche Anordnungen zu bilden. Jedes HALV-Gefäß fasst bis zu 10 ml Medium und ermöglicht eine konstante Zirkulation von Nährstoffen, so dass jede Zelle eine ausgezeichnete Überlebenschance hat. Abbildung 1A zeigt die Befestigung der Spritzenöffnungen an der Frontplatte des Behälters, an der sterile E…

Discussion

Kritische Schritte des Protokolls für das Wachstum von Zellen in Schwerelosigkeit umfassen den Bioreaktor, das Gerüst, die für die 3D-Kultur verwendeten Zellen und die Gerüstbeschichtung als Mittel zur Induktion der Zelldifferenzierung. Der in unseren Studien verwendete Bioreaktortyp umfasst den RCCS-4-Bioreaktor, eine neue Modifikation des ursprünglichen rotierenden zylindrischen Gewebekulturgeräts Rotary Cell Culture System (RCCS), das von der NASA entwickelt wurde, um Zellen in simulierter Schwerelosigkeit zu z?…

Materials

Antibiotic-antimycotic	ThermoFisher Scientfic	15240096
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A4544
BGJb Fitton-Jackson Modification media	ThermoFisher Scientfic	12591
BIOST PGA scaffold	Synthecon	Custom	Available from the company through a custom order
BMP-2	R&D Systems	355-BM
BMP-4	R&D Systems	314-BP
DMEM Media	Sigma Aldrich	D6429-500mL
FBS	ThermoFisher Scientfic	16140071
Fibricol	Advanced Biomatrix	5133-20mL
Fibronectin	Corning	354008
Galanin	Sigma Aldrich	G-0278
Gelatin disc	Advanced Biomatrix	CytoForm 500
Graphene sheets	Advanced Biomatrix	CytoForm 300
hEGF	Peprotech	AF-100-15
hFGF	ThermoFisher Scientfic	AA1-155
Hydroxyapatite disc	Advanced Biomatrix	CytoForm 200
Il-6 protein	PeproTech	200-06
Keratinocyte SFM media (1X)	ThermoFisher Scientfic	17005042
Laminin	Corning	354259
LRAP peptide	Peptide 2.0	Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD
Matrigel	Corning	354234
Millipore Nitrocellulose membrane	Merck Millipore	AABP04700
RCCS Bioreactor	Synthecon	RCCS 4HD
SpongeCol	Advanced Biomatrix	5135-25EA
Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock	Smiths Medical	MX5-61L
Syringes with needle 3cc	McKESSON	16-SN3C211
Trypsin EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientfic	25200056