Размножение зубных и дыхательных клеток и органов в условиях микрогравитации
Summary
Этот протокол представляет собой метод культивирования и 3D-роста амелобластоподобных клеток в условиях микрогравитации для поддержания их удлиненной и поляризованной формы, а также экспрессии белка, специфичной для эмали. Описаны условия культивирования пародонтальных инженерных конструкций и органов легких в условиях микрогравитации.
Abstract
Гравитация является одним из ключевых факторов, определяющих функцию клеток человека, пролиферацию, цитоскелетную архитектуру и ориентацию. Ротационные биореакторные системы (RCCS) имитируют потерю гравитации, как это происходит в космосе, и вместо этого обеспечивают микрогравитационную среду за счет непрерывного вращения культивируемых клеток или тканей. Эти RCCS обеспечивают бесперебойную подачу питательных веществ, факторов роста и транскрипции, а также кислорода и устраняют некоторые недостатки гравитационных сил в неподвижных 2D (двухмерных) чашках для культуры клеток или органов. В настоящем исследовании мы использовали RCCS для совместной культивирования клеток цервикальной петли и клеток пульпы зубов, чтобы стать амелобластами, для характеристики взаимодействий предшественника пародонта / каркаса и для определения влияния воспаления на альвеолы легких. Среда RCCS способствовала росту амелобластоподобных клеток, способствовала пролиферации предшественников пародонта в ответ на покрытия каркасов и позволяла оценить влияние воспалительных изменений на культивируемые альвеолы легких. Эта рукопись обобщает условия окружающей среды, материалы и шаги на этом пути и освещает критические аспекты и экспериментальные детали. В заключение, RCCS являются инновационными инструментами для освоения культуры и 3D (трехмерного) роста клеток in vitro и позволяют изучать клеточные системы или взаимодействия, не поддающиеся классическим средам 2D-культур.
Introduction
Гравитация влияет на все аспекты жизни на Земле, включая биологию отдельных клеток и их функцию в организмах. Клетки ощущают гравитацию через механорецепторы и реагируют на изменения гравитации, реконфигурируя цитоскелетные архитектуры и изменяя деление клеток 1,2,3. Другие эффекты микрогравитации включают гидростатическое давление в заполненных жидкостью везикулах, осаждение органелл и конвекцию потока и тепла, управляемую плавучестью4. Исследования влияния потери гравитации на клетки и органы человека первоначально проводились для моделирования невесомой космической среды на астронавтов во время космических полетов5. Однако в последние годы эти технологии 3D-биореакторов, первоначально разработанные НАСА для моделирования микрогравитации, становятся все более актуальными в качестве новых подходов к культуре клеточных популяций, которые в противном случае не поддаются системам 2D-культур.
3D-биореакторы имитируют микрогравитацию, выращивая клетки в суспензии и, таким образом, создавая постоянный эффект «свободного падения». Другие преимущества вращающихся биореакторов включают отсутствие воздействия воздуха, встречающегося в системах культивирования органов, снижение напряжения сдвига и турбулентности, а также постоянное воздействие изменяющегося запаса питательных веществ. Эти динамические условия, обеспечиваемые биореактором Rotary Cell Culture System (RCCS), способствуют пространственной колокализации и трехмерной сборке отдельных клеток в агрегаты 6,7.
Предыдущие исследования продемонстрировали преимущества ротационного биореактора для регенерации кости8, культуры зародышей зуба9 и для культуры клеток зубного фолликула человека10. Также был опубликован доклад, предполагающий, что RCCS усиливает пролиферацию и дифференцировку клеток EOE в амелобласты11. Однако дифференцированные клетки считали амелобластами на основе иммунофлуоресценции амелобластина и/или экспрессии амелогенина только11 без учета их удлиненной морфологии или поляризованной формы клеток.
В дополнение к разработанному НАСА биореактору вращающихся стеновых сосудов (RWV), другие технологии для генерации 3D-агрегатов из клеток включают магнитную левитацию, машину случайного позиционирования (RPM) и клиностат12. Для достижения магнитной левитации клетки, помеченные магнитными наночастицами, левитируют с использованием внешней магнитной силы, что приводит к образованию 3D-структур без каркаса, которые были использованы для биофабрикации адипоцитарных структур 13,14,15. Другим подходом к моделированию микрогравитации является генерация разнонаправленных G-сил путем управления одновременным вращением вокруг двух осей, что приводит к отмене кумулятивного вектора гравитации в центре устройства, называемого клиностатом16. Когда стволовые клетки костного мозга культивировали в клиностате, образование новой кости ингибировалось путем подавления дифференцировки остеобластов, что иллюстрирует один из дедифференцирующих эффектов микрогравитации16.
Системы in vitro для облегчения верной культуры амелобластов обеспечат важный шаг вперед к тканевой инженерии зубной эмали17. К сожалению, на сегодняшний день культура амелобластов была сложным делом18,19. До сих пор сообщалось о пяти различных амелобластоподобных клеточных линиях, включая клеточную линию амелобласта мыши (ALC), линию эпителиальных клеток зубов крыс (HAT-7), клеточную линию LS8 мыши20, клеточную линию PABSo-Eсвиней 21 и клеточную линию SF2-24крысы 22. Однако большинство этих клеток потеряли свою отличительную поляризованную форму клеток в 2D-культуре.
В настоящем исследовании мы обратились к системе биореакторов ротационных клеточных культур (RCCS) для облегчения роста амелобластоподобных клеток из эпителия шейного контура, культивируемого совместно с мезенхимальными предшественниками, и для преодоления проблем систем 2D-культур, включая снижение потока питательных веществ и цитоскелетные изменения из-за гравитации. Кроме того, RCCS предоставил новые возможности для изучения взаимодействия клеток / каркасов, связанных с тканевой инженерией пародонта, и для изучения воздействия воспалительных медиаторов на альвеолярные ткани легких in vitro. В совокупности результаты этих исследований подчеркивают преимущества систем ротационных культур на основе микрогравитации для распространения дифференцированного эпителия и для оценки воздействия окружающей среды на клетки, выращенные in vitro, включая взаимодействия клетки / каркас и реакцию тканей на воспалительные состояния.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические этапы протокола для роста клеток в условиях микрогравитации включают биореактор, каркас, клетки, используемые для 3D-культуры, и покрытие каркаса в качестве средства для индуцирования дифференцировки клеток. Тип биореактора, используемого в наших исследованиях, включает в …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования были щедро поддержаны грантами Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (UG3-DE028869 и R01-DE027930).
Materials
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -. y., Wang, X. -. m., Li, X. -. y. An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au – Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
