微小重力下での歯科および呼吸器細胞および臓器の増殖
Summary
このプロトコルは、微小重力下でのアメロブラスト様細胞の培養と3D増殖を行い、細長い偏光形状とエナメル質特異的タンパク質発現を維持する方法を提示します。微小重力下での歯周工学コンストラクトや肺器官の培養のための培養条件についても記載する。
Abstract
重力は、ヒトの細胞機能、増殖、細胞骨格構造および配向の重要な決定要因の1つです。ロータリーバイオリアクターシステム(RCCS)は、宇宙で発生する重力の損失を模倣し、代わりに培養細胞または組織の連続的な回転によって微小重力環境を提供します。これらのRCCSは、栄養素、成長および転写因子、および酸素の途切れのない供給を保証し、動かない2D(2次元)細胞または臓器培養皿における重力の欠点のいくつかに対処します。本研究では、RCCSを用いて頸部ループ細胞と歯髄細胞を共培養してアメロブラストにし、歯周前駆細胞と足場の相互作用を特徴づけ、肺胞に対する炎症の影響を決定しました。RCCS環境は、アメロブラスト様細胞の増殖を促進し、足場コーティングに応答して歯周前駆細胞の増殖を促進し、培養肺胞に対する炎症変化の影響の評価を可能にしました。この原稿は、環境条件、材料、および途中の手順を要約し、重要な側面と実験の詳細を強調しています。結論として、RCCSは、 in vitroでの 細胞の培養と3D(3次元)増殖を習得し、従来の2D培養環境には適さない細胞システムまたは相互作用の研究を可能にする革新的なツールです。
Introduction
重力は、個々の細胞の生物学や生物内でのそれらの機能など、地球上の生命のあらゆる側面に影響を与えます。細胞は機械受容器を通して重力を感知し、細胞骨格構造を再構成し、細胞分裂を変化させることによって重力の変化に応答します1,2,3。微小重力の他の影響には、流体で満たされた小胞の静水圧、細胞小器官の沈降、および浮力による流れと熱の対流が含まれます4。人間の細胞や臓器に対する重力の喪失の影響に関する研究は、もともと宇宙飛行ミッション中に宇宙飛行士の無重力環境をシミュレートするために行われました5。しかし、近年、微小重力をシミュレートするためにNASAによって最初に開発されたこれらの3Dバイオリアクター技術は、他の方法では2D培養システムには適さない細胞集団の培養のための新しいアプローチとしてますます関連性が高まっています。
3Dバイオリアクターは、浮遊状態で細胞を成長させることによって微小重力をシミュレートし、一定の「自由落下」効果を生み出します。回転バイオリアクターの他の利点には、臓器培養システムで遭遇する空気曝露の欠如、せん断応力と乱流の減少、および変化する栄養素の供給への継続的な曝露が含まれます。ロータリー細胞培養システム(RCCS)バイオリアクターによって提供されるこれらの動的条件は、単一細胞の凝集体への空間共局在および三次元アセンブリに有利に働く6,7。
これまでの研究では、骨再生8、歯胚培養9、およびヒト歯包細胞の培養10に対する回転式バイオリアクターの利点が実証されています。RCCSがEOE細胞の増殖とアメロブラストへの分化を促進することを示唆する報告もあります11。しかし、分化した細胞は、アメロブラスチン免疫蛍光および/またはアメロゲニン発現のみに基づいてアメロブラストと見なされました11 、その細長い形態や分極した細胞形状は考慮されていませんでした。
NASAが開発した回転壁船(RWV)バイオリアクターに加えて、細胞から3D凝集体を生成する他の技術には、磁気浮上、ランダム位置決め機(RPM)、およびクリノスタット12が含まれます。磁気浮上を達成するために、磁性ナノ粒子で標識された細胞は、外部磁力を用いて浮上され、その結果、脂肪細胞構造のバイオファブリケーションに使用されてきた足場のない3D構造が形成される13、14、15。微小重力をシミュレートする別のアプローチは、2つの軸を中心とした同時回転を制御することにより、多方向のG力を生成し、クリノスタット16と呼ばれる装置の中心での累積重力ベクトルをキャンセルすることです。骨髄幹細胞をクリノスタットで培養すると、骨芽細胞分化の抑制を通じて新たな骨形成が抑制され、微小重力の脱分化効果の1つが示されています16。
アメロブラストの忠実な培養を促進するためのin vitroシステムは、歯のエナメル質組織工学17に向けて大きな前進をもたらすでしょう。残念ながら、今日まで、アメロブラストの文化は挑戦的な事業でした18,19。これまでに、マウスアメロブラスト系譜細胞株(ALC)、ラット歯科上皮細胞株(HAT-7)、マウスLS8細胞株20、ブタPABSo-E細胞株21およびラットSF2-24細胞株22を含む5つの異なるアメロブラスト様細胞株が報告されている。しかし、これらの細胞の大部分は、2D培養で独特の分極細胞形状を失っています。
本研究では、間葉系前駆細胞と共培養した子宮頸管ループ上皮からのアメロブラスト様細胞の増殖を促進し、栄養素の流れの減少や重力による細胞骨格の変化など、2D培養システムの課題を克服するために、回転細胞培養バイオリアクターシステム(RCCS)に目を向けました。さらに、RCCSは、歯周組織工学に関連する細胞/足場相互作用の研究、およびin vitroでの肺胞組織に対する炎症メディエーターの影響を調べるための新しい手段を提供しました。これらの研究の結果は、分化した上皮の増殖、および細胞/足場の相互作用や炎症状態に対する組織反応など、 in vitroで増殖した細胞に対する環境影響の評価に対する微小重力ベースの回転培養システムの利点を強調しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
微小重力下での細胞の増殖のためのプロトコルの重要なステップには、バイオリアクター、足場、3D培養に使用される細胞、および細胞分化を誘導する手段としての足場コーティングが含まれます。私たちの研究で使用されるバイオリアクターのタイプは、シミュレートされた微小重力で細胞を成長させるためにNASAによって開発された元の回転細胞培養システム(RCCS)回転円筒組織培養装置の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、国立歯科頭蓋顔面研究所(UG3-DE028869およびR01-DE027930)からの助成金によって寛大に支援されました。
Materials
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
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