Voortplanting van tandheelkundige en respiratoire cellen en organen in microzwaartekracht
Summary
Dit protocol presenteert een methode voor de kweek en 3D-groei van ameloblastachtige cellen in microzwaartekracht om hun langwerpige en gepolariseerde vorm en glazuurspecifieke eiwitexpressie te behouden. Kweekomstandigheden voor de kweek van parodontale engineeringconstructies en longorganen in microzwaartekracht worden ook beschreven.
Abstract
Zwaartekracht is een van de belangrijkste determinanten van menselijke celfunctie, proliferatie, cytoskeletale architectuur en oriëntatie. Roterende bioreactorsystemen (RCCSs) bootsen het verlies van zwaartekracht na zoals het in de ruimte optreedt en bieden in plaats daarvan een microzwaartekrachtomgeving door continue rotatie van gekweekte cellen of weefsels. Deze RCCS’en zorgen voor een ononderbroken toevoer van voedingsstoffen, groei- en transcriptiefactoren en zuurstof, en pakken enkele van de tekortkomingen van zwaartekrachten in onbeweeglijke 2D (tweedimensionale) cel- of orgaancultuurschotels aan. In de huidige studie hebben we RCS’en gebruikt om cervicale luscellen en tandpulpcellen te cokweken om ameloblasten te worden, om parodontale voorloper / steigerinteracties te karakteriseren en om het effect van ontsteking op longblaasjes te bepalen. De RCCS-omgevingen vergemakkelijkten de groei van ameloblastachtige cellen, bevorderden parodontale voorloperproliferatie als reactie op steigercoatings en maakten een beoordeling mogelijk van de effecten van inflammatoire veranderingen op gekweekte longblaasjes. Dit manuscript vat de omgevingsomstandigheden, materialen en stappen onderweg samen en belicht kritieke aspecten en experimentele details. Kortom, RCCS’en zijn innovatieve hulpmiddelen om de cultuur en 3D (driedimensionale) groei van cellen in vitro onder de knie te krijgen en om de studie van cellulaire systemen of interacties mogelijk te maken die niet vatbaar zijn voor klassieke 2D-cultuuromgevingen.
Introduction
Zwaartekracht beïnvloedt alle aspecten van het leven op aarde, inclusief de biologie van individuele cellen en hun functie binnen organismen. Cellen voelen zwaartekracht door middel van mechanoreceptoren en reageren op veranderingen in de zwaartekracht door cytoskeletale architecturen opnieuw te configureren en door de celdelingte veranderen 1,2,3. Andere effecten van microzwaartekracht zijn de hydrostatische druk in met vloeistof gevulde blaasjes, sedimentatie van organellen en door drijfvermogen aangedreven convectie van stroming en warmte4. Studies naar het effect van verlies van zwaartekracht op menselijke cellen en organen werden oorspronkelijk uitgevoerd om de gewichtloze omgeving van de ruimte op astronauten tijdens ruimtevluchtmissies te simuleren5. In de afgelopen jaren worden deze 3D-bioreactortechnologieën die oorspronkelijk door NASA zijn ontwikkeld om microzwaartekracht te simuleren, echter steeds relevanter als nieuwe benaderingen voor de cultuur van celpopulaties die anders niet vatbaar zijn voor 2D-cultuursystemen.
3D-bioreactoren simuleren microzwaartekracht door cellen in suspensie te laten groeien en zo een constant “vrije val” -effect te creëren. Andere voordelen van de roterende bioreactoren zijn het gebrek aan blootstelling aan lucht in orgaankweeksystemen, een vermindering van schuifspanning en turbulentie en een continue blootstelling aan een veranderende toevoer van voedingsstoffen. Deze dynamische omstandigheden die worden geboden door een rotary cell culture system (RCCS) bioreactor bevorderen ruimtelijke co-lokalisatie en driedimensionale assemblage van enkele cellen tot aggregaten 6,7.
Eerdere studies hebben de voordelen aangetoond van een roterende bioreactor voor botregeneratie8, tandkiemcultuur9 en voor de kweek van menselijke tandheelkundige follikelcellen10. Er is ook een rapport dat suggereert dat RCCS de proliferatie en differentiatie van EOE-cellen in ameloblastenverbetert 11. Gedifferentieerde cellen werden echter beschouwd als ameloblasten op basis van ameloblastine-immunofluorescentie en / of amelogenine-expressie alleen11 zonder rekening te houden met hun langwerpige morfologie of gepolariseerde celvorm.
Naast de door NASA ontwikkelde rotating wall vessels (RWV) bioreactor, omvatten andere technologieën om 3D-aggregaten uit cellen te genereren magnetische levitatie, de random positioning machine (RPM) en de clinostat12. Om magnetische levitatie te bereiken, worden cellen gelabeld met magnetische nanodeeltjes zweven met behulp van een externe magnetische kracht, wat resulteert in de vorming van steigervrije 3D-structuren die zijn gebruikt voor de biofabricage van adipocytenstructuren 13,14,15. Een andere benadering om microzwaartekracht te simuleren is het genereren van multidirectionele G-krachten door gelijktijdige rotatie over twee assen te regelen, wat resulteert in een annulering van de cumulatieve zwaartekrachtvector in het midden van een apparaat genaamd clinostat16. Wanneer beenmergstamcellen werden gekweekt in een clinostat, werd nieuwe botvorming geremd door de onderdrukking van osteoblastdifferentiatie, wat een van de dedifferentiërende effecten van microzwaartekracht illustreert16.
In vitro systemen om de trouwe kweek van ameloblasten te vergemakkelijken, zouden een belangrijke stap voorwaarts zijn in de richting van tandglazuur tissue engineering17. Helaas is de cultuur van ameloblasten tot op heden een uitdagende onderneming geweest18,19. Tot nu toe zijn vijf verschillende ameloblastachtige cellijnen gemeld, waaronder de muis ameloblast-lijn cellijn (ALC), de rat tandheelkundige epitheelcellijn (HAT-7), de muis LS8 cellijn20, het varkensPABSo-E cellijn21 en de rat SF2-24 cellijn22. De meerderheid van deze cellen heeft echter hun kenmerkende gepolariseerde celvorm verloren in 2D-cultuur.
In de huidige studie hebben we ons gewend tot een Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) om de groei van ameloblastachtige cellen uit cervicale lus epithelia samen gekweekt met mesenchymale voorlopers te vergemakkelijken en om de uitdagingen van 2D-kweeksystemen te overwinnen, waaronder verminderde stroom van voedingsstoffen en cytoskeletale veranderingen als gevolg van zwaartekracht. Daarnaast heeft de RCCS nieuwe wegen geboden voor de studie van cel/scaffold interacties gerelateerd aan parodontale weefselmanipulatie en om de effecten van inflammatoire mediatoren op longalveolaire weefsels in vitro te onderzoeken. Samen benadrukken de resultaten van deze studies de voordelen van op microzwaartekracht gebaseerde rotatiecultuursystemen voor de voortplanting van gedifferentieerde epithelia en voor de beoordeling van milieueffecten op cellen die in vitro zijn gekweekt, inclusief cel/ scaffold-interacties en de weefselrespons op ontstekingsaandoeningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen van het protocol voor de groei van cellen in microzwaartekracht zijn de bioreactor, de steiger, de cellen die worden gebruikt voor 3D-cultuur en de steigercoating als middel om celdifferentiatie te induceren. Het type bioreactor dat in onze studies wordt gebruikt, omvat de RCCS-4-bioreactor, een recente wijziging van het originele roterende celkweeksysteem (RCCS) roterende cilindrische weefselkweekapparaat dat door NASA is ontwikkeld om cellen in gesimuleerde microzwaartekracht te laten groeien. Deze RC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studies werden genereus ondersteund door subsidies van het National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 en R01-DE027930).
Materials
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -. y., Wang, X. -. m., Li, X. -. y. An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au – Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
