该协议提出了一种在微重力下培养和3D生长釉质母细胞样细胞的方法,以保持其细长和极化形状以及牙釉质特异性蛋白质表达。还描述了微重力下牙周工程结构和肺器官培养的培养条件。
重力是人体细胞功能、增殖、细胞骨架结构和取向的关键决定因素之一。旋转生物反应器系统(RCCS)模拟在太空中发生的重力损失,而是通过连续旋转培养的细胞或组织来提供微重力环境。这些RCCS确保营养,生长和转录因子以及氧气的不间断供应,并解决了静止的2D(二维)细胞或器官培养皿中重力的一些缺点。在本研究中,我们使用RCCS共培养宫颈环细胞和牙髓细胞成为釉质母细胞,表征牙周祖细胞/支架相互作用,并确定炎症对肺泡的影响。RCCS环境促进了釉母细胞样细胞的生长,促进了牙周祖细胞增殖以响应支架涂层,并允许评估炎症变化对培养的肺泡的影响。这份手稿总结了沿途的环境条件、材料和步骤,并突出了关键方面和实验细节。总之,RCCS是掌握 体外 细胞培养和3D(三维)生长的创新工具,并允许研究不适合经典2D培养环境的细胞系统或相互作用。
重力影响地球上生命的方方面面,包括单个细胞的生物学及其在生物体内的功能。细胞通过机械感受器感知重力,并通过重新配置细胞骨架结构和改变细胞分裂来响应重力的变化1,2,3。微重力的其他影响包括流体填充囊泡中的静水压力,细胞器的沉降以及浮力驱动的流动和热量对流4。关于重力损失对人体细胞和器官影响的研究最初是为了模拟太空飞行任务期间宇航员的失重环境5。然而,近年来,这些最初由NASA开发的用于模拟微重力的3D生物反应器技术正变得越来越重要,作为细胞群培养的新方法,否则不适合2D培养系统。
3D生物反应器通过在悬浮液中培养细胞来模拟微重力,从而产生持续的“自由落体”效果。旋转生物反应器的其他优点包括器官培养系统中没有空气暴露,剪切应力和湍流减少,以及持续暴露于不断变化的营养供应中。旋转细胞培养系统(RCCS)生物反应器提供的这些动态条件有利于空间共定位和单细胞聚集体的三维组装6,7。
以前的研究已经证明了旋转生物反应器在骨再生8,牙胚培养9和人类牙囊细胞培养10方面的优势。还有一份报告表明,RCCS增强EOE细胞增殖和分化为釉母细胞11。然而,分化的细胞被认为是基于釉质母细胞蛋白免疫荧光和/或仅釉质生成素表达的釉质母细胞11 ,而不考虑其细长的形态或极化细胞形状。
除了NASA开发的旋转壁容器(RWV)生物反应器外,从细胞生成3D聚集体的其他技术包括磁悬浮,随机定位机(RPM)和clinostat12。为了实现磁悬浮,用磁性纳米颗粒标记的细胞使用外部磁力悬浮,从而形成无支架的3D结构,这些结构已用于脂肪细胞结构的生物制造13,14,15。模拟微重力的另一种方法是通过控制围绕两个轴的同时旋转来产生多向 G 力,从而消除称为 clinostat16 的设备中心的累积重力矢量。当骨髓干细胞在抑溪恒温器中培养时,通过抑制成骨细胞分化来抑制新的骨形成,说明了微重力16的去分化作用之一。
促进釉质母细胞忠实培养的体外系统将为牙釉质组织工程迈出重要一步17。不幸的是,到目前为止,鳞翅目鳞翅目到目前为止,已经报道了五种不同的釉质母细胞样细胞系,包括小鼠釉质母细胞系细胞系(ALC),大鼠牙齿上皮细胞系(HAT-7),小鼠LS8细胞系20,猪PABSo-E细胞系21和大鼠SF2-24细胞系22。然而,这些细胞中的大多数在2D培养中失去了其独特的极化细胞形状。
在本研究中,我们转向旋转细胞培养生物反应器系统(RCCS),以促进与间充质祖细胞共培养的宫颈环上皮的釉母细胞样细胞的生长,并克服2D培养系统的挑战,包括营养物质流动减少和重力引起的细胞骨架变化。此外,RCCS为研究与牙周组织工程相关的细胞/支架相互作用以及检查炎症介质对体 外肺泡组织的影响提供了新的途径。总之,这些研究的结果强调了基于微重力的旋转培养系统在分化上皮的繁殖和评估环境对 体外生长细胞的影响方面的益处,包括细胞/支架相互作用和组织对炎症状况的反应。
在微重力下细胞生长方案的关键步骤包括生物反应器,支架,用于3D培养的细胞以及作为诱导细胞分化手段的支架涂层。我们研究中使用的生物反应器类型包括RCCS-4生物反应器,这是NASA开发的原始旋转细胞培养系统(RCCS)旋转圆柱形组织培养装置的最新修改,用于在模拟微重力下生长细胞。这种RCCS-4环境提供了极低的剪切应力,从而增强了传质并改善了培养性能。这个版本的生物反应器允许同时…
The authors have nothing to disclose.
研究得到了国家牙科和颅面研究所(UG3-DE028869和R01-DE027930)的慷慨资助。
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
Fibronectin | Corning | 354008 | |
Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
Laminin | Corning | 354259 | |
LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
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Matrigel | Corning | 354234 | |
Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |