Denne protokol præsenterer en metode til dyrkning og 3D-vækst af ameloblast-lignende celler i mikrogravity for at opretholde deres aflange og polariserede form samt emaljespecifikke proteinekspression. Kulturbetingelser for kulturen af periodontale ingeniørkonstruktioner og lungeorganer i mikrogravitet er også beskrevet.
Tyngdekraften er en af de vigtigste determinanter for menneskelig cellefunktion, proliferation, cytoskeletal arkitektur og orientering. Roterende bioreaktorsystemer (RCCS’er) efterligner tabet af tyngdekraften, når det forekommer i rummet, og giver i stedet et mikrogravitetsmiljø gennem kontinuerlig rotation af dyrkede celler eller væv. Disse RCCS’er sikrer en uafbrudt forsyning af næringsstoffer, vækst- og transkriptionsfaktorer og ilt og adresserer nogle af manglerne ved tyngdekraften i ubevægelige 2D (todimensionelle) celle- eller organkulturretter. I denne undersøgelse har vi brugt RCCS’er til at samdyrke cervikale loopceller og tandmasseceller til at blive ameloblaster, til at karakterisere periodontale stamfader / stilladsinteraktioner og til at bestemme effekten af betændelse på lungealveoler. RCCS-miljøerne lettede væksten af ameloblast-lignende celler, fremmede periodontal progenitorproliferation som reaktion på stilladsbelægninger og tillod en vurdering af virkningerne af inflammatoriske ændringer på dyrkede lungealveoler. Dette manuskript opsummerer miljøforholdene, materialerne og trinene undervejs og fremhæver kritiske aspekter og eksperimentelle detaljer. Afslutningsvis er RCCS’er innovative værktøjer til at mestre kulturen og 3D (tredimensionel) vækst af celler in vitro og give mulighed for undersøgelse af cellulære systemer eller interaktioner, der ikke er modtagelige for klassiske 2D-kulturmiljøer.
Tyngdekraften påvirker alle aspekter af livet på Jorden, herunder biologien af individuelle celler og deres funktion i organismer. Celler registrerer tyngdekraften gennem mekanoreceptorer og reagerer på ændringer i tyngdekraften ved at omkonfigurere cytoskeletale arkitekturer og ved at ændre celledeling 1,2,3. Andre virkninger af mikrogravitet inkluderer det hydrostatiske tryk i væskefyldte vesikler, sedimentering af organeller og opdriftsdrevet konvektion af flow og varme4. Undersøgelser af effekten af tab af tyngdekraft på humane celler og organer blev oprindeligt udført for at simulere det vægtløse miljø i rummet på astronauter under rumflyvningsmissioner5. I de senere år er disse 3D-bioreaktorteknologier, der oprindeligt blev udviklet af NASA til at simulere mikrogravitet, imidlertid blevet mere og mere relevante som nye tilgange til kulturen af cellepopulationer, der ellers ikke er modtagelige for 2D-kultursystemer.
3D-bioreaktorer simulerer mikrogravitet ved at dyrke celler i suspension og dermed skabe en konstant “frit fald” -effekt. Andre fordele ved de roterende bioreaktorer omfatter manglen på lufteksponering i organkultursystemer, en reduktion i forskydningsspænding og turbulens og en kontinuerlig eksponering for en skiftende forsyning af næringsstoffer. Disse dynamiske betingelser leveret af en Rotary Cell Culture System (RCCS) bioreaktor favoriserer rumlig co-lokalisering og tredimensionel samling af enkeltceller i aggregater 6,7.
Tidligere undersøgelser har vist fordelene ved en roterende bioreaktor til knogleregenerering8, tandkimkultur9 og til dyrkning af humane tandfollikelceller10. Der har også været en rapport, der tyder på, at RCCS forbedrer EOE-celleproliferation og differentiering i ameloblaster11. Imidlertid blev differentierede celler betragtet som ameloblaster baseret på ameloblastinimmunfluorescens og / eller amelogeninekspression alene11 uden at overveje deres aflange morfologi eller polariserede celleform.
Ud over den NASA-udviklede roterende vægbeholder (RWV) bioreaktor omfatter andre teknologier til generering af 3D-aggregater fra celler magnetisk levitation, den tilfældige positioneringsmaskine (RPM) og clinostat12. For at opnå magnetisk levitation leviteres celler mærket med magnetiske nanopartikler ved hjælp af en ekstern magnetisk kraft, hvilket resulterer i dannelsen af stilladsfrie 3D-strukturer, der er blevet brugt til biofabrikation af adipocytstrukturer13,14,15. En anden tilgang til simulering af mikrogravitet er dannelsen af multidirektionelle G-kræfter ved at kontrollere samtidig rotation omkring to akser, hvilket resulterer i en annullering af den kumulative tyngdekraftsvektor i midten af en enhed kaldet clinostat16. Når knoglemarvsstamceller blev dyrket i en clinostat, blev ny knogledannelse hæmmet gennem undertrykkelse af osteoblastdifferentiering, hvilket illustrerer en af de dedifferentierende virkninger af mikrogravitet16.
In vitro-systemer til at lette den trofaste ameloblastkultur ville være et stort skridt fremad mod tandemaljevævsteknik17. Desværre har ameloblastskulturen indtil nu været en udfordrende opgave18,19. Indtil videre er fem forskellige ameloblast-lignende cellelinjer blevet rapporteret, herunder musens ameloblast-afstamningscellelinje (ALC), rottetandepitelcellelinjen (HAT-7), musens LS8-cellelinje20, den svine PABSo-E-cellelinje 21 og rotten SF2-24 cellelinje22. Imidlertid har størstedelen af disse celler mistet deres karakteristiske polariserede celleform i 2D-kultur.
I denne undersøgelse har vi henvendt os til et Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) for at lette væksten af ameloblastlignende celler fra cervikal loop-epitelia, der er samdyrket med mesenkymale forfædre og for at overvinde udfordringerne ved 2D-kultursystemer, herunder reduceret strøm af næringsstoffer og cytoskeletale ændringer på grund af tyngdekraften. Derudover har RCCS givet nye muligheder for undersøgelse af celle / stilladsinteraktioner relateret til periodontal vævsteknik og til at undersøge virkningerne af inflammatoriske mediatorer på lungealveolært væv in vitro. Tilsammen fremhæver resultaterne fra disse undersøgelser fordelene ved mikrogravity-baserede rotatoriske kultursystemer til udbredelse af differentieret epitel og til vurdering af miljøvirkninger på celler dyrket in vitro, herunder celle/stilladsinteraktioner og vævets respons på inflammatoriske tilstande.
Kritiske trin i protokollen for vækst af celler i mikrogravitet inkluderer bioreaktoren, stilladset, cellerne, der anvendes til 3D-kultur, og stilladsbelægningen som et middel til at inducere celledifferentiering. Den type bioreaktor, der anvendes i vores undersøgelser, omfatter RCCS-4 bioreaktoren, en nylig ændring af det originale Rotary Cell Culture System (RCCS) roterende cylindrisk vævskulturenhed udviklet af NASA til at dyrke celler i simuleret mikrogravitet. Dette RCCS-4-miljø giver ekstremt lave forskydning…
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelser blev generøst støttet af tilskud fra National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 og R01-DE027930).
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
Fibronectin | Corning | 354008 | |
Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
Laminin | Corning | 354259 | |
LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
Matrigel | Corning | 354234 | |
Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |