Förökning av tand- och andningsceller och organ i mikrogravitation
Summary
Detta protokoll presenterar en metod för odling och 3D-tillväxt av ameloblastliknande celler i mikrogravitation för att bibehålla sin långsträckta och polariserade form samt emaljspecifikt proteinuttryck. Odlingsförhållanden för odling av parodontala ingenjörskonstruktioner och lungorgan i mikrogravitation beskrivs också.
Abstract
Gravitation är en av de viktigaste determinanterna för mänsklig cellfunktion, spridning, cytoskeletal arkitektur och orientering. Roterande bioreaktorsystem (RCCS) efterliknar tyngdkraftsförlusten när den sker i rymden och ger istället en mikrogravitationsmiljö genom kontinuerlig rotation av odlade celler eller vävnader. Dessa RCCS säkerställer en oavbruten tillförsel av näringsämnen, tillväxt- och transkriptionsfaktorer och syre och tar itu med några av bristerna i gravitationskrafter i orörliga 2D (tvådimensionella) cell- eller organodlingsrätter. I den aktuella studien har vi använt RCCS för att samodla cervikala loopceller och tandmassaceller för att bli ameloblaster, för att karakterisera parodontala stam- / ställningsinteraktioner och för att bestämma effekten av inflammation på lungalveoler. RCCS-miljöerna underlättade tillväxten av ameloblastliknande celler, främjade periodontal stamfaderproliferation som svar på ställningsbeläggningar och möjliggjorde en bedömning av effekterna av inflammatoriska förändringar på odlade lungalveoler. Detta manuskript sammanfattar miljöförhållandena, materialen och stegen på vägen och belyser kritiska aspekter och experimentella detaljer. Sammanfattningsvis är RCCS innovativa verktyg för att behärska odling och 3D (tredimensionell) tillväxt av celler in vitro och för att möjliggöra studier av cellulära system eller interaktioner som inte är mottagliga för klassiska 2D-odlingsmiljöer.
Introduction
Gravitationen påverkar alla aspekter av livet på jorden, inklusive biologin hos enskilda celler och deras funktion inom organismer. Celler känner av gravitation genom mekanoreceptorer och svarar på förändringar i tyngdkraften genom att omkonfigurera cytoskelettarkitekturer och genom att ändra celldelning 1,2,3. Andra effekter av mikrogravitation inkluderar det hydrostatiska trycket i vätskefyllda vesiklar, sedimentering av organeller och flytkraftsdriven konvektion av flöde och värme4. Studier om effekten av tyngdkraftsförlust på mänskliga celler och organ genomfördes ursprungligen för att simulera den viktlösa miljön i rymden på astronauter under rymdflygningsuppdrag5. Under de senaste åren har dock dessa 3D-bioreaktortekniker som ursprungligen utvecklats av NASA för att simulera mikrogravitation blivit alltmer relevanta som nya metoder för odling av cellpopulationer som annars inte är mottagliga för 2D-odlingssystem.
3D-bioreaktorer simulerar mikrogravitation genom att odla celler i suspension och därmed skapa en konstant “fritt fall” -effekt. Andra fördelar med de roterande bioreaktorerna inkluderar bristen på luftexponering som uppstår i organodlingssystem, en minskning av skjuvspänning och turbulens och en kontinuerlig exponering för en förändrad tillförsel av näringsämnen. Dessa dynamiska förhållanden som tillhandahålls av en RVCS-bioreaktor (Rotary Cell Culture System) gynnar rumslig samlokalisering och tredimensionell montering av enskilda celler i aggregat 6,7.
Tidigare studier har visat fördelarna med en roterande bioreaktor för benregenerering8, tandgroddsodling9 och för odling av mänskliga tandfollikelceller10. Det har också förekommit en rapport som tyder på att RCCS förbättrar cellproliferation och differentiering av EOE till ameloblaster11. Differentierade celler betraktades emellertid som ameloblaster baserade på ameloblastinimmunofluorescens och/eller ameloginuttryck ensamt11 utan hänsyn till deras långsträckta morfologi eller polariserade cellform.
Förutom den NASA-utvecklade bioreaktorn för roterande väggkärl (RWV) inkluderar andra tekniker för att generera 3D-aggregat från celler magnetisk levitation, slumpmässig positioneringsmaskin (RPM) och clinostat12. För att uppnå magnetisk levitation leviteras celler märkta med magnetiska nanopartiklar med hjälp av en extern magnetisk kraft, vilket resulterar i bildandet av ställningsfria 3D-strukturer som har använts för biofabricering av adipocytstrukturer13,14,15. Ett annat tillvägagångssätt för att simulera mikrogravitation är genereringen av multidirektionella G-krafter genom att styra samtidig rotation runt två axlar vilket resulterar i en annullering av den kumulativa tyngdkraftsvektorn i mitten av en enhet som kallas clinostat16. När benmärgsstamceller odlades i en kliostat hämmades ny benbildning genom undertryckande av osteoblastdifferentiering, vilket illustrerar en av de dedifferentierande effekterna av mikrogravitation16.
In vitro-system för att underlätta den trogna kulturen av ameloblaster skulle ge ett stort steg framåt mot tandemaljens vävnadsteknik17. Tyvärr har ameloblasternas kultur hittills varit ett utmanande företag18,19. Hittills har fem olika ameloblastliknande cellinjer rapporterats, inklusive musens ameloblast-härstamningscellinje (ALC), råttans dentala epitelcellinje (HAT-7), musens LS8-cellinje20, svin PABSo-E-cellinjen 21 och råttan SF2-24 cellinje22. Majoriteten av dessa celler har dock förlorat sin distinkta polariserade cellform i 2D-odling.
I den aktuella studien har vi vänt oss till ett Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) för att underlätta tillväxten av ameloblastliknande celler från cervikal loopepitel som odlas tillsammans med mesenkymala stamfäder och för att övervinna utmaningarna med 2D-odlingssystem, inklusive minskat flöde av näringsämnen och cytoskelettförändringar på grund av tyngdkraften. Dessutom har RCCS tillhandahållit nya vägar för studier av cell-/ställningsinteraktioner relaterade till parodontal vävnadsteknik och för att undersöka effekterna av inflammatoriska mediatorer på lungalveolära vävnader in vitro. Tillsammans belyser resultaten från dessa studier fördelarna med mikrogravitationsbaserade rotatoriska odlingssystem för förökning av differentierad epitel och för bedömning av miljöeffekter på celler som odlas in vitro, inklusive cell/ ställningsinteraktioner och vävnadssvaret på inflammatoriska tillstånd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet för tillväxt av celler i mikrogravitation inkluderar bioreaktorn, byggnadsställningen, cellerna som används för 3D-odling och ställningsbeläggningen som ett sätt att inducera celldifferentiering. Den typ av bioreaktor som används i våra studier omfattar RCCS-4-bioreaktorn, en ny modifiering av den ursprungliga roterande cylindriska vävnadsodlingsanordningen (Rotary Cell Culture System) som utvecklats av NASA för att odla celler i simulerad mikrogravitation. Denna RCCS-4-miljö ger …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studierna stöddes generöst av bidrag från National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 och R01-DE027930).
Materials
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -. y., Wang, X. -. m., Li, X. -. y. An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au – Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
