Настоящий протокол описывает улучшенную методологию изоляции ADSC, приводящую к огромному клеточному выходу с увеличением времени по сравнению с литературой. Это исследование также предоставляет простой метод получения относительно большого количества жизнеспособных клеток после длительной криоконсервации.
Мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из жировой ткани, становятся все более привлекательными, поскольку они демонстрируют соответствующие особенности и являются доступным источником для регенеративных клинических применений. Различные протоколы были использованы для получения стволовых клеток, полученных из жировой ткани. В этой статье описываются различные этапы улучшенного протокола экономии времени для получения более значительного количества ADSC, показывая, как криоконсервировать и размораживать ADSC для получения жизнеспособных клеток для расширения культуры. Сто миллилитров липоаспирата были собраны с помощью липосакции шприца калибра 26 см и калибра 3 мм из области живота девяти пациентов, которые впоследствии прошли плановую абдоминопластику. Выделение стволовых клеток проводилось серией промывок раствором фосфатного буферного физиологического раствора (DPBS) Dulbecco, дополненным кальцием, и использованием коллагеназы. Клетки стромальной сосудистой фракции (SVF) были криоконсервированы, и их жизнеспособность была проверена иммунофенотипированием. Клеточный выход SVF составлял 15,7 x 105 клеток/мл, в диапазоне от 6,1 до 26,2 клеток/мл. Адгезивные клетки SVF достигали слияния в среднем через 7,5 (±4,5) дней, со средним клеточным выходом 12,3 (± 5,7) х 105 клеток / мл. Жизнеспособность размороженного SVF через 8 месяцев, 1 год и 2 года колебалась между 23,06%-72,34% в среднем 47,7% (±24,64) с самой низкой жизнеспособностью, коррелирующей со случаями двухлетней заморозки. Использование раствора DPBS, дополненного кальцием и временем отдыха мешков для осаждения жира с более коротким временем переваривания коллагеназы, привело к увеличению конечного клеточного выхода стволовых клеток. Детальная процедура получения высоких урожаев жизнеспособных стволовых клеток была более эффективной с точки зрения времени и клеточного выхода, чем методы из предыдущих исследований. Даже после длительного периода криоконсервации в SVF были обнаружены жизнеспособные клетки ADSC.
Мезенхимальные стволовые клетки человека выгодны как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Использование этого типа взрослых клеток преодолевает этические вопросы по сравнению с использованием эмбриональных или других клеток, являясь одним из наиболее перспективных направлений исследований в области инженерии регенерации аутологичных тканей и клеточной терапии1, таких как опухолевая область, лечение дегенеративных заболеваний и терапевтические применения в области реконструктивной хирургии 2,3,4, 5. Ранее сообщалось, что существует обильный источник мезенхимальных мультипотентных и плюрипотентных стволовых клеток в стромальной сосудистой клеточной фракции жировой ткани 6,7. Эти ADSC считаются отличными кандидатами для использования в клеточной терапии и трансплантации / инфузии, поскольку значительное количество клеток с сильной способностью к расширению ex vivo может быть легко получено с высоким выходом из минимально инвазивной процедуры 5,8.
Было также продемонстрировано, что жировая ткань обладает большей способностью обеспечивать мезенхимальные стволовые клетки, чем два других источника (ткань костного мозга и пуповины)9. Помимо того, что ADSC плохо иммуногенен и обладает высокой способностью интегрироваться в ткань хозяина и взаимодействовать с окружающими тканями 4,10, ОН обладает мультипотентной способностью дифференцировки в клеточные линии, с сообщениями о хондрогенной, остеогенной и миогенной дифференцировке в соответствующих условиях культивирования 11,12,13, и в клетки, такие как поджелудочная железа, гепатоциты, и нейрогенные клетки 14,15,16.
Научное сообщество сходится во мнении, что иммуномодулирующее действие мезенхимальных стволовых клеток является более актуальным механизмом действия клеточной терапии 17,18,19, чем их свойство дифференцировки. Одним из наиболее значимых достоинств применения ADSC является возможность аутологичной инфузии или пересадки, становящейся альтернативным лечением нескольких заболеваний. Для регенеративной медицины ADSC уже применялись в случаях повреждения печени, реконструкции сердечной мышцы, регенерации нервной ткани, улучшения функции скелетных мышц, регенерации костей, терапии рака и лечения диабета20,21.
На сегодняшний день зарегистрировано 263 клинических испытания для оценки потенциала ADSC, перечисленных на веб-сайте Национальных институтов здоровья22 США. Были установлены различные протоколы сбора жировой ткани, но в литературе нет единого мнения о стандартизированном методе выделения ADSC для клинического использования23,24. Методы обработки липоаспирата во время и после операции могут непосредственно влиять на жизнеспособность клеток, конечный клеточный выход25 и качество популяции ADSC20. Что касается хирургического предварительного лечения, то не установлено, какой хирургический метод предварительного лечения дает более значительное количество жизнеспособных клеток после выделения или влияет ли раствор анестетика, введенный в жировую ткань, на выход клеток и их функции26. Аналогичным образом, разница между методами получения жировых клеток может привести к 70% уменьшению количества жизнеспособных ADSC20. Согласно литературе, следует избегать механических методов лечения для получения клеточных популяций с высокой жизнеспособностью, включая ультразвук, поскольку они могут разрушить жировуюткань 20. Тем не менее, ручной метод аспирации жира со шприцами менее вреден, вызывая меньшее разрушение клеток, при этом тумесцентная липосакция дает значительное количество клеток с лучшим качеством26.
В этой методике используется солевой раствор с лидокаином и адреналином, который вводится в область липосакции. На каждые 3 мл объема вводимого раствора аспирируется 1 мл. В этом исследовании была выполнена методика влажной липосакции, при которой на каждый 1 мл введенного адреналина и физиологического раствора аспирируется 0,2 мл жировой ткани. Использование пищеварительных ферментов, особенно коллагеназы, является общим для процесса выделения ADSC.
После первого этапа выделения в лаборатории конечная гранула называется стромальной сосудистой фракцией (SVF). Он содержит различные типы клеток27, включая эндотелиальные клетки-предшественники, эндотелиальные клетки, макрофаги, гладкомышечные клетки, лимфоциты, перициты, преадипоциты и ADSC, которые способны к адгезии. Как только окончательное выделение заключено из культур in vitro , клетки, которые не прилипли к пластику, удаляются в средах обмена. После восьми недель расширения, средних изменений и проходов, ADSC представляют большую часть клеточной популяции в колбах20. Одним из наиболее значительных преимуществ использования изолированных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для возможной будущей терапии является возможность криоконсервации. Было продемонстрировано, что криоконсервированный липоаспират является потенциальным источником SVF-клеток даже после 6 недель замораживания28, с биологической активностью даже после 2 лет криоконсервации29 и полной способностью расти и дифференцироваться в культуре30. Однако в процессе оттаивания значительного процента клеток обычно теряется31. Поэтому процесс удаления липоаспирата и следующие методы изоляции клеток должны обеспечивать самый высокий выход клеток.
Это исследование описывает более быструю методологию сбора и изоляции ADSC, демонстрирующую высокий клеточный выход и жизнеспособность для повышения эффективности клеточной терапии. Кроме того, был оценен эффект этого улучшенного метода после длительной криоконсервации SVF.
Выход изоляции
Хорошо известно, что процесс криоконсервации, часто необходимый в клеточной терапии, приводит к значительной потере клеток, иногда превышающей 50%29,30,35. Таким образом, техническое усовершенствование для получе…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим пациентов, которые вызвались принять участие, а также медицинский и сестринский персонал больницы Сан-Паулу. Это исследование было поддержано Фондом организации ампаро в Пескизе Сан-Паулу (ФАПЕСП) и Национальным советом по вопросам образования и развития (CNPq), Бразилия.
1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |