Методика получения мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани и характеристика стромальной сосудистой фракции при длительной криоконсервации

Summary

Настоящий протокол описывает улучшенную методологию изоляции ADSC, приводящую к огромному клеточному выходу с увеличением времени по сравнению с литературой. Это исследование также предоставляет простой метод получения относительно большого количества жизнеспособных клеток после длительной криоконсервации.

Abstract

Мезенхимальные стволовые клетки человека, полученные из жировой ткани, становятся все более привлекательными, поскольку они демонстрируют соответствующие особенности и являются доступным источником для регенеративных клинических применений. Различные протоколы были использованы для получения стволовых клеток, полученных из жировой ткани. В этой статье описываются различные этапы улучшенного протокола экономии времени для получения более значительного количества ADSC, показывая, как криоконсервировать и размораживать ADSC для получения жизнеспособных клеток для расширения культуры. Сто миллилитров липоаспирата были собраны с помощью липосакции шприца калибра 26 см и калибра 3 мм из области живота девяти пациентов, которые впоследствии прошли плановую абдоминопластику. Выделение стволовых клеток проводилось серией промывок раствором фосфатного буферного физиологического раствора (DPBS) Dulbecco, дополненным кальцием, и использованием коллагеназы. Клетки стромальной сосудистой фракции (SVF) были криоконсервированы, и их жизнеспособность была проверена иммунофенотипированием. Клеточный выход SVF составлял 15,7 x 10⁵ клеток/мл, в диапазоне от 6,1 до 26,2 клеток/мл. Адгезивные клетки SVF достигали слияния в среднем через 7,5 (±4,5) дней, со средним клеточным выходом 12,3 (± 5,7) х 10⁵ клеток / мл. Жизнеспособность размороженного SVF через 8 месяцев, 1 год и 2 года колебалась между 23,06%-72,34% в среднем 47,7% (±24,64) с самой низкой жизнеспособностью, коррелирующей со случаями двухлетней заморозки. Использование раствора DPBS, дополненного кальцием и временем отдыха мешков для осаждения жира с более коротким временем переваривания коллагеназы, привело к увеличению конечного клеточного выхода стволовых клеток. Детальная процедура получения высоких урожаев жизнеспособных стволовых клеток была более эффективной с точки зрения времени и клеточного выхода, чем методы из предыдущих исследований. Даже после длительного периода криоконсервации в SVF были обнаружены жизнеспособные клетки ADSC.

Introduction

Мезенхимальные стволовые клетки человека выгодны как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Использование этого типа взрослых клеток преодолевает этические вопросы по сравнению с использованием эмбриональных или других клеток, являясь одним из наиболее перспективных направлений исследований в области инженерии регенерации аутологичных тканей и клеточной терапии¹, таких как опухолевая область, лечение дегенеративных заболеваний и терапевтические применения в области реконструктивной хирургии ^{2,3,4, 5}. Ранее сообщалось, что существует обильный источник мезенхимальных мультипотентных и плюрипотентных стволовых клеток в стромальной сосудистой клеточной фракции жировой ткани ^6,7. Эти ADSC считаются отличными кандидатами для использования в клеточной терапии и трансплантации / инфузии, поскольку значительное количество клеток с сильной способностью к расширению ex vivo может быть легко получено с высоким выходом из минимально инвазивной процедуры ^5,8.

Было также продемонстрировано, что жировая ткань обладает большей способностью обеспечивать мезенхимальные стволовые клетки, чем два других источника (ткань костного мозга и пуповины)⁹. Помимо того, что ADSC плохо иммуногенен и обладает высокой способностью интегрироваться в ткань хозяина и взаимодействовать с окружающими тканями ^4,10, ОН обладает мультипотентной способностью дифференцировки в клеточные линии, с сообщениями о хондрогенной, остеогенной и миогенной дифференцировке в соответствующих условиях культивирования 11,12,13, и в клетки, такие как поджелудочная железа, гепатоциты, и нейрогенные клетки 14,15,16.

Научное сообщество сходится во мнении, что иммуномодулирующее действие мезенхимальных стволовых клеток является более актуальным механизмом действия клеточной терапии 17,18,19, чем их свойство дифференцировки. Одним из наиболее значимых достоинств применения ADSC является возможность аутологичной инфузии или пересадки, становящейся альтернативным лечением нескольких заболеваний. Для регенеративной медицины ADSC уже применялись в случаях повреждения печени, реконструкции сердечной мышцы, регенерации нервной ткани, улучшения функции скелетных мышц, регенерации костей, терапии рака и лечения диабета^20,21.

На сегодняшний день зарегистрировано 263 клинических испытания для оценки потенциала ADSC, перечисленных на веб-сайте Национальных институтов здоровья²² США. Были установлены различные протоколы сбора жировой ткани, но в литературе нет единого мнения о стандартизированном методе выделения ADSC для клинического использования^23,24. Методы обработки липоаспирата во время и после операции могут непосредственно влиять на жизнеспособность клеток, конечный клеточный выход²⁵ и качество популяции ADSC²⁰. Что касается хирургического предварительного лечения, то не установлено, какой хирургический метод предварительного лечения дает более значительное количество жизнеспособных клеток после выделения или влияет ли раствор анестетика, введенный в жировую ткань, на выход клеток и их функции²⁶. Аналогичным образом, разница между методами получения жировых клеток может привести к 70% уменьшению количества жизнеспособных ADSC²⁰. Согласно литературе, следует избегать механических методов лечения для получения клеточных популяций с высокой жизнеспособностью, включая ультразвук, поскольку они могут разрушить жировую^{ткань 20}. Тем не менее, ручной метод аспирации жира со шприцами менее вреден, вызывая меньшее разрушение клеток, при этом тумесцентная липосакция дает значительное количество клеток с лучшим качеством²⁶.

В этой методике используется солевой раствор с лидокаином и адреналином, который вводится в область липосакции. На каждые 3 мл объема вводимого раствора аспирируется 1 мл. В этом исследовании была выполнена методика влажной липосакции, при которой на каждый 1 мл введенного адреналина и физиологического раствора аспирируется 0,2 мл жировой ткани. Использование пищеварительных ферментов, особенно коллагеназы, является общим для процесса выделения ADSC.

После первого этапа выделения в лаборатории конечная гранула называется стромальной сосудистой фракцией (SVF). Он содержит различные типы клеток²⁷, включая эндотелиальные клетки-предшественники, эндотелиальные клетки, макрофаги, гладкомышечные клетки, лимфоциты, перициты, преадипоциты и ADSC, которые способны к адгезии. Как только окончательное выделение заключено из культур in vitro , клетки, которые не прилипли к пластику, удаляются в средах обмена. После восьми недель расширения, средних изменений и проходов, ADSC представляют большую часть клеточной популяции в колбах²⁰. Одним из наиболее значительных преимуществ использования изолированных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, для возможной будущей терапии является возможность криоконсервации. Было продемонстрировано, что криоконсервированный липоаспират является потенциальным источником SVF-клеток даже после 6 недель замораживания²⁸, с биологической активностью даже после 2 лет криоконсервации²⁹ и полной способностью расти и дифференцироваться в культуре³⁰. Однако в процессе оттаивания значительного процента клеток обычно теряется³¹. Поэтому процесс удаления липоаспирата и следующие методы изоляции клеток должны обеспечивать самый высокий выход клеток.

Это исследование описывает более быструю методологию сбора и изоляции ADSC, демонстрирующую высокий клеточный выход и жизнеспособность для повышения эффективности клеточной терапии. Кроме того, был оценен эффект этого улучшенного метода после длительной криоконсервации SVF.

Protocol

Настоящее исследование одобрено Комитетом по этике UNIFESP (протокольный номер: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), выполнено после получения письменного информированного согласия от пациентов в соответствии с Хельсинкской декларацией (2004). Выборка настоящего исследования состоит из девяти пациенток…

Representative Results

Характеристика девяти изученных лиц, включая их возраст, вес, рост и ИМТ, приведена в таблице 1. В соответствии с первоначально представленным клеточным выходом, объем клеток, привитых в культуре, был рассчитан как максимально приближенный к емкости колбы культу?…

Discussion

Выход изоляции
Хорошо известно, что процесс криоконсервации, часто необходимый в клеточной терапии, приводит к значительной потере клеток, иногда превышающей 50%29,30,35. Таким образом, техническое усовершенствование для получе…

Materials

1.8 mL cryovials	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag	JP FARMA	80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2	Sigma Aldrich	A5533
Adrenaline (1 mg/mL)	Hipolabor	NA
Alcian Blue solution	Sigma Aldrich	1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x	Gibco	15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis	BD BioSciences	NA
Calcium chloride 10%	Merck	102379
Chlorhexidine gluconate 4%	VIC PHARMA	NA
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)	Gibco	11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285601
Fetal bovine serum	Gibco	10500056
Formaldehyde 4%	Sigma Aldrich	1,00,496
Inverted light microscope	Nikon Eclipse TS100	NA
Live and Dead Cell Assay	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105	BD BioSciences	745927
Monoclonal antibody: CD11B	BD BioSciences	746004
Monoclonal antibody: CD19	BD BioSciences	745907
Monoclonal antibody: CD34	BD BioSciences	747822
Monoclonal antibody: CD45	DAKO	M0701
Monoclonal antibody: CD73	BD BioSciences	746000
Monoclonal antibody: CD90	BD BioSciences	553011
Monoclonal antibody: HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4	Gibco	10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site	Origen Biomedical Connector, USA	NA	Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%	Sigma Aldrich	93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red	Gibco	25200056