O presente protocolo descreve uma metodologia aprimorada para o isolamento de ADSC, resultando em um tremendo rendimento celular com ganho de tempo em comparação com a literatura. Este estudo também fornece um método simples para a obtenção de um número relativamente grande de células viáveis após a crioppreservação a longo prazo.
As células-tronco mesenquimais humanas derivadas do tecido adiposo tornaram-se cada vez mais atraentes, pois apresentam características apropriadas e são uma fonte acessível para aplicações clínicas regenerativas. Diferentes protocolos têm sido utilizados para a obtenção de células-tronco derivadas de tecido adiposo. Este artigo descreve diferentes etapas de um protocolo de economia de tempo aprimorado para obter uma quantidade mais significativa de ADSC, mostrando como criopreservar e descongelar o ADSC para obter células viáveis para expansão da cultura. Cem mililitros de lipoaspirado foram coletados, utilizando-se lipoaspiração de seringa de 26 cm de três orifícios e calibre de 3 mm, da região abdominal de nove pacientes que posteriormente foram submetidos à abdominoplastia eletiva. O isolamento das células-tronco foi realizado com uma série de lavagens com solução de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco suplementada com cálcio e o uso de colagenase. As células da Fração Vascular Estromal (SVF) foram criopreservadas, e sua viabilidade foi verificada por imunofenotipagem. O rendimento celular de SVF foi de 15,7 x 105 células/mL, variando entre 6,1-26,2 células/mL. As células SVF aderentes atingiram confluência após uma média de 7,5 (±4,5) dias, com um rendimento celular médio de 12,3 (± 5,7) x 105 células/mL. A viabilidade da FSV descongelada após 8 meses, 1 ano e 2 anos variou entre 23,06%-72,34%, com média de 47,7% (±24,64) com a menor viabilidade correlacionando-se com os casos de congelamento em dois anos. O uso de solução de DPBS suplementada com cálcio e tempos de repouso da bolsa para precipitação de gordura com menor tempo de digestão da colagenase resultou em um aumento do rendimento celular final de células-tronco. O procedimento detalhado para obtenção de altas produtividades de células-tronco viáveis foi mais eficiente em relação ao tempo e rendimento celular do que as técnicas de estudos anteriores. Mesmo após um longo período de criopreservação, células ADSC viáveis foram encontradas na SVF.
As células-tronco mesenquimais humanas são vantajosas tanto na pesquisa básica quanto na aplicada. O uso desse tipo de célula adulta supera questões éticas – em comparação com o uso de células embrionárias ou outras – sendo uma das áreas de estudo mais promissoras em engenharia de regeneração de tecidos autólogos e terapia celular1, como a área neoplásica, o tratamento de doenças degenerativas e aplicações terapêuticas na área de cirurgia reconstrutiva 2,3,4, 5. Já foi relatado anteriormente que existe uma fonte abundante de células-tronco mesenquimais multipotentes e pluripotentes na fração celular vascular estromal do tecido adiposo 6,7. Esses ADSC são considerados grandes candidatos para uso em terapia celular e transplante/infusão, uma vez que um número considerável de células com forte capacidade de expansão ex vivo pode ser facilmente obtido com alto rendimento a partir de um procedimento minimamente invasivo 5,8.
Também foi demonstrado que o tecido adiposo apresenta maior capacidade de fornecer células-tronco mesenquimais do que duas outras fontes (medula óssea e tecido do cordão umbilical)9. Além de ser pouco imunogênica e de ter alta capacidade de integração no tecido hospedeiro e de interação com os tecidos circundantes4,10, a ADSC possui uma capacidade multipotente de diferenciação em linhagens celulares, com relatos de diferenciação condrogênica, osteogênica e miogênica em condições de cultura adequadas 11,12,13, e em células, como pancreáticas, hepatócitos, e células neurogênicas14,15,16.
A comunidade científica concorda que o efeito imunomodulador das células-tronco mesenquimais é um mecanismo de ação mais relevante para a terapia celular17,18,19 do que sua propriedade de diferenciação. Um dos méritos mais significativos do uso do ADSC é a possibilidade de infusão ou enxerto autólogo, tornando-se uma alternativa de tratamento para diversas doenças. Para a medicina regenerativa, o ADSC já tem sido utilizado em casos de lesão hepática, reconstrução do músculo cardíaco, regeneração do tecido nervoso, melhora da função muscular esquelética, regeneração óssea, terapia do câncer e tratamento do diabetes20,21.
Até o momento, existem 263 ensaios clínicos registrados para a avaliação do potencial do ADSC, listados no site dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos22. Diferentes protocolos para a colheita de tecido adiposo têm sido estabelecidos, mas não há consenso na literatura sobre um método padronizado para isolar a ADSC para uso clínico23,24. Os métodos de processamento de lipoaspirados durante e após a cirurgia podem afetar diretamente a viabilidade celular, o rendimento celular final25 e a qualidade da população de ADSC20. Em relação ao pré-tratamento cirúrgico, não está bem estabelecido qual técnica cirúrgica de pré-tratamento produz um número mais significativo de células viáveis após o isolamento ou se a solução anestésica injetada no tecido adiposo afeta o rendimento celular e suas funções26. Da mesma forma, a diferença entre as técnicas de obtenção de células adiposas pode levar a uma diminuição de até 70% no número de ADSC viáveis20. De acordo com a literatura, tratamentos mecânicos para obtenção de populações celulares com alta viabilidade – incluindo ultrassonografia – devem ser evitados, pois podem decompor o tecido adiposo20. No entanto, o método de aspiração manual de gordura com seringas é menos prejudicial, causando menor destruição celular, com a lipoaspiração tumescente produzindo um número significativo de células com a melhor qualidade26.
Esta técnica utiliza uma solução salina com lidocaína e epinefrina que é injetada na área de lipoaspiração. Para cada volume de 3 ml de solução injetada, 1 ml é aspirado. Neste estudo, foi realizada a técnica de lipoaspiração úmida, na qual para cada 1 mL de adrenalina e solução salina injetados, 0,2 mL de tecido adiposo é aspirado. O uso de enzimas digestivas, especialmente a colagenase, é comum para o processo de isolamento do ADSC.
Após a primeira etapa de isolamento em laboratório, o pellet final é chamado de fração vascular estromal (SVF). Contém diferentes tipos de células27, incluindo células precursoras endoteliais, células endoteliais, macrófagos, células musculares lisas, linfócitos, pericitos, pré-adipócitos e ADSCs, que são capazes de aderência. Uma vez concluído o isolamento final a partir de culturas in vitro , as células que não aderiram ao plástico são eliminadas em trocas médias. Após oito semanas de expansão, mudanças de meio e passagens, os ADSCs representam a maior parte da população celular nos frascos20. Uma das vantagens mais significativas do uso de células-tronco isoladas derivadas de tecido adiposo para uma possível terapia futura é a possibilidade de criopreservação. Demonstrou-se que o lipoaspirado criopreservado é uma fonte potencial de células SVF mesmo após 6 semanas de congelamento28, com atividade biológica mesmo após 2 anos de criopreservação29, e plena capacidade de crescimento e diferenciação em cultura30. No entanto, durante o processo de descongelamento, uma porcentagem considerável de células geralmente é perdida31. Portanto, o processo de remoção de lipoaspirados e os seguintes métodos de isolamento celular devem garantir o maior rendimento celular.
Este estudo descreve uma metodologia mais rápida para coleta e isolamento de ADSC, demonstrando alto rendimento celular e viabilidade para melhor eficiência da terapêutica celular. Além disso, avaliou-se o efeito dessa técnica aprimorada após a criopreservação da SVF em longo prazo.
Rendimento de isolamento
Está bem estabelecido que o processo de criopreservação, frequentemente necessário na terapia celular, resulta em perda celular significativa, às vezes superior a 50%29,30,35. Assim, um aprimoramento técnico para a obtenção de alto rendimento celular inicial isoladamente é fundamental. O método de coleta de lipoaspirado e o método de isolamento das células devem se concent…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos aos pacientes que se ofereceram para participar e à equipe médica e de enfermagem do Hospital São Paulo. Este estudo foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil.
1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |