Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methodik zur ADSC-Isolierung, die im Vergleich zur Literatur zu einer enormen zellulären Ausbeute mit Zeitgewinn führt. Diese Studie bietet auch eine einfache Methode, um eine relativ große Anzahl lebensfähiger Zellen nach langfristiger Kryokonservierung zu erhalten.
Abstract
Humane mesenchymale Stammzellen aus Fettgewebe sind zunehmend attraktiver geworden, da sie geeignete Merkmale aufweisen und eine zugängliche Quelle für regenerative klinische Anwendungen darstellen. Verschiedene Protokolle wurden verwendet, um aus Fett gewonnene Stammzellen zu erhalten. Dieser Artikel beschreibt verschiedene Schritte eines verbesserten zeitsparenden Protokolls, um eine signifikantere Menge an ADSC zu erhalten, und zeigt, wie ADSC kryokonserviert und aufgetaut wird, um lebensfähige Zellen für die Kulturexpansion zu erhalten. Einhundert Milliliter Lipoaspirate wurden mit einer 26 cm langen Dreiloch- und 3-mm-Spritzen-Fettabsaugung aus dem Bauchbereich von neun Patienten entnommen, die sich anschließend einer elektiven Bauchdeckenstraffung unterzogen. Die Isolierung der Stammzellen wurde mit einer Reihe von Wäschen mit Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) -Lösung, ergänzt mit Kalzium und der Verwendung von Kollagenase, durchgeführt. Zellen der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) wurden kryokonserviert und ihre Lebensfähigkeit wurde durch Immunphänotypisierung überprüft. Die SVF-Zellausbeute betrug 15,7 x 105 Zellen / ml, zwischen 6,1-26,2 Zellen / ml. Adhärente SVF-Zellen erreichten nach durchschnittlich 7,5 (±4,5) Tagen eine Konfluenz mit einer durchschnittlichen Zellausbeute von 12,3 (± 5,7) x 105 Zellen/ml. Die Lebensfähigkeit von aufgetautem SVF nach 8 Monaten, 1 Jahr und 2 Jahren lag zwischen 23,06% und 72,34% mit einem Durchschnitt von 47,7% (±24,64), wobei die niedrigste Lebensfähigkeit mit Fällen von zweijährigem Einfrieren korrelierte. Die Verwendung von DPBS-Lösung, ergänzt mit Kalzium und Beutelruhezeiten für die Fettfällung mit einer kürzeren Zeit der Kollagenase-Verdauung, führte zu einer erhöhten Zellendausbeute der Stammzellen. Das detaillierte Verfahren zur Erzielung hoher Ausbeuten lebensfähiger Stammzellen war in Bezug auf Zeit und Zellertrag effizienter als die Techniken aus früheren Studien. Selbst nach einer langen Zeit der Kryokonservierung wurden lebensfähige ADSC-Zellen im SVF gefunden.
Introduction
Humane mesenchymale Stammzellen sind sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der angewandten Forschung von Vorteil. Die Verwendung dieses adulten Zelltyps überwindet ethische Fragen - verglichen mit der Verwendung embryonaler oder anderer Zellen - und ist eines der vielversprechendsten Forschungsgebiete in der autologen Geweberegeneration und Zelltherapie1, wie der neoplastische Bereich, die Behandlung degenerativer Erkrankungen und therapeutische Anwendungen im Bereich der rekonstruktiven Chirurgie 2,3,4, 5. Es wurde bereits berichtet, dass es eine reichliche Quelle von mesenchymalen multipotenten und pluripotenten Stammzellen in der stromalen vaskulären Zellfraktion des Fettgewebesgibt 6,7. Diese ADSC gelten als hervorragende Kandidaten für den Einsatz in der Zelltherapie und Transplantation/Infusion, da eine beträchtliche Anzahl von Zellen mit einer starken Expansionskapazität ex vivo leicht mit einer hohen Ausbeute aus einem minimalinvasiven Verfahren gewonnen werden kann 5,8.
Es wurde auch gezeigt, dass Fettgewebe eine größere Fähigkeit zur Bereitstellung mesenchymaler Stammzellen aufweist als zwei andere Quellen (Knochenmark und Nabelschnurgewebe)9. ADSC ist nicht nur schlecht immunogen und besitzt eine hohe Fähigkeit, sich in das Wirtsgewebe zu integrieren und mit dem umgebenden Gewebe zu interagieren4,10, sondern hat auch eine multipotente Fähigkeit zur Differenzierung in Zelllinien, mit Berichten über chondrogene, osteogene und myogene Differenzierung unter geeigneten Kulturbedingungen11,12,13, und in Zellen wie Pankreas, Hepatozyten, und neurogene Zellen14,15,16.
Die wissenschaftliche Gemeinschaft ist sich einig, dass die immunmodulatorische Wirkung der mesenchymalen Stammzellen ein relevanterer Wirkmechanismus für die Zelltherapieist 17,18,19 als ihre Differenzierungseigenschaft. Einer der wichtigsten Vorteile der ADSC-Verwendung ist die Möglichkeit der autologen Infusion oder Transplantation, die zu einer alternativen Behandlung für mehrere Krankheiten wird. Für die regenerative Medizin wurden ADSC bereits bei Leberschäden, Rekonstruktion des Herzmuskels, Regeneration von Nervengewebe, Verbesserung der Skelettmuskelfunktion, Knochenregeneration, Krebstherapie und Diabetesbehandlung eingesetzt20,21.
Bis heute gibt es 263 registrierte klinische Studien zur Bewertung des Potenzials von ADSC, die auf der Website der United States National Institutes of Health22 aufgeführt sind. Verschiedene Protokolle zur Entnahme von Fettgewebe wurden etabliert, aber es gibt keinen Konsens in der Literatur über eine standardisierte Methode zur Isolierung von ADSC für den klinischen Gebrauch23,24. Lipoaspirate-Verarbeitungsmethoden während und nach der Operation können sich direkt auf die Zelllebensfähigkeit, die endgültige Zellausbeute25 und die Qualität der ADSC-Population20 auswirken. In Bezug auf die chirurgische Vorbehandlung ist nicht genau bekannt, welche chirurgische Vorbehandlungstechnik nach der Isolierung eine signifikantere Anzahl lebensfähiger Zellen ergibt oder ob die in das Fettgewebe injizierte Anästhesielösung die Zellausbeute und ihre Funktionen beeinflusst26. In ähnlicher Weise kann der Unterschied zwischen den Techniken zur Gewinnung von Fettzellen zu einer Verringerung der Anzahl lebensfähiger ADSC 20 um bis zu70% führen. Nach der Literatur sollten mechanische Behandlungen zur Gewinnung von Zellpopulationen mit hoher Lebensfähigkeit - einschließlich Ultraschall - vermieden werden, da sie das Fettgewebe abbauen können20. Die manuelle Fettaspirationsmethode mit Spritzen ist jedoch weniger schädlich und verursacht weniger Zellzerstörung, wobei die Tumeszenzfettabsaugung eine signifikante Anzahl von Zellen mit der besten Qualität ergibt26.
Diese Technik verwendet eine Kochsalzlösung mit Lidocain und Epinephrin, die in den Fettabsaugungsbereich injiziert wird. Für jedes injizierte 3-ml-Volumen der injizierten Lösung wird 1 ml aspiriert. In dieser Studie wurde die nasse Fettabsaugungstechnik durchgeführt, bei der für jeden injizierten 1 ml Adrenalin und Kochsalzlösung 0,2 ml Fettgewebe abgesaugt werden. Die Verwendung von Verdauungsenzymen, insbesondere Kollagenase, ist für den Prozess der Isolierung von ADSC üblich.
Nach dem ersten Isolationsschritt im Labor wird das endgültige Pellet als stromale vaskuläre Fraktion (SVF) bezeichnet. Es enthält verschiedene Zelltypen27, einschließlich endothelialer Vorläuferzellen, Endothelzellen, Makrophagen, glatter Muskelzellen, Lymphozyten, Perizyten, Präadipozyten und ADSCs, die adhäsionsfähig sind. Sobald die endgültige Isolierung aus In-vitro-Kulturen abgeschlossen ist, werden Zellen, die nicht am Kunststoff haften, im Medienaustausch eliminiert. Nach acht Wochen Expansion, Mediumsveränderungen und Passagen repräsentieren ADSCs den größten Teil der Zellpopulation in den Kolben20. Einer der wichtigsten Vorteile der Verwendung isolierter Stammzellen aus Fettgeweben für eine mögliche zukünftige Therapie ist die Möglichkeit der Kryokonservierung. Es wurde gezeigt, dass kryokonserviertes Lipoaspirate auch nach 6 Wochen des Einfrierens eine potenzielle Quelle von SVF-Zellen ist28, mit biologischer Aktivität auch nach 2 Jahren Kryokonservierung29 und voller Fähigkeit, in Kultur30 zu wachsen und zu differenzieren. Während des Auftauvorgangs geht jedoch in der Regel ein erheblicher Prozentsatz der Zellen verloren31. Daher müssen der Prozess der Lipoaspirateentfernung und die folgenden Methoden der Zellisolierung die höchste Zellausbeute gewährleisten.
Diese Studie beschreibt eine schnellere Methodik zur Erfassung und Isolierung von ADSC und zeigt eine hohe Zellausbeute und Lebensfähigkeit für eine bessere Effizienz von Zelltherapeutika. Darüber hinaus wurde die Wirkung dieser verbesserten Technik nach Langzeit-SVF-Kryokonservierung evaluiert.
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Protocol
Die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission der UNIFESP genehmigt (Protokollnummer: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), durchgeführt nach schriftlicher Einverständniserklärung der Patienten gemäß der Deklaration von Helsinki (2004). Die Stichprobe der vorliegenden Studie besteht aus neun Patientinnen im Alter von 33 bis 50 Jahren (Durchschnittsalter 41,5 Jahre) und einem durchschnittlichen anfänglichen Body-Mass-Index (BMI) von 24,54 (zwischen 22,32 und 26,77) (Tabelle 1), die sich einer ästhetischen Bauchdeckenstraffung aufgrund eines Hautüberschusses nach Schwangerschaften in der Abteilung für Plastische Chirurgie der Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) unterzogen haben. Brazilien. Um Verzerrungen zu reduzieren, wurden die Patienten als homogene Gruppe unter Berücksichtigung von Geschlecht, Alter und BMI ausgewählt. Die während dieser Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf angemessene Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.
1. Sammlung von Lipoaspirate
HINWEIS: Dieser Schritt muss im Operationszentrum durchgeführt werden.
- Verwenden Sie 4% Chlorhexidingluconat (siehe Materialtabelle) für die Hautvorbereitung und Asepsis.
- Führen Sie einen 2 mm subkutanen Hautschnitt durch (zwischen der Unterdermis und der Aponeurose). Führen Sie eine Klein-Kanüle von 26 mm 3 G Dreiloch- und 3-mm-Kaliber und eine Spritze ein, um ein Gesamtvolumen von 500 ml einer Adrenalinlösung (1 mg/ml) (siehe Materialtabelle) in Kochsalzlösung (1:1.000.000) im infraumbilicalen Bereich zu injizieren.
- Schließen Sie eine 60-ml-Spritze an eine 26 mm 3 G Dreiloch- und 3-mm-Fettabsaugungskanüle an und führen Sie sie durch den Hautschnitt ein, wobei der Kolben verriegelt wird, um ein Vakuum zu erzeugen.
- Führen Sie Schiebe- und Zugbewegungen aus, so dass das Lipoaspirate mit dem erzeugten Vakuum in der 60-ml-Spritze verbleibt.
- Die 100 ml des gesammelten Lipoaspirates werden mit einem sterilen Stecker mit einem Ventil in einen 150-ml-Polyvinylchlorid-Transferbeutel überführt (siehe Materialtabelle).
- Packen Sie den Transferbeutel in eine Styroporbox bei Raumtemperatur (~25 °C) und bringen Sie ihn sofort ins Labor. Nehmen Sie sich nicht länger als 30 Minuten Zeit, um mit der Gewebeverarbeitung zu beginnen.
2. Verarbeitung von Lipoaspirate
HINWEIS: Dieser Schritt muss im Labor durchgeführt werden.
- Wiegen Sie zuerst den Beutel, messen Sie die Temperatur mit einem digitalen berührungslosen Infrarot-Klinikthermometer und lassen Sie den Beutel 5 Minuten in der Laminar-Flow-Kammer ruhen, um die fettigeren Schichten (Blasen) und die Gewebetrennung mit den interessierenden Zellen auszufällen.
- Führen Sie eine Reihe von Taschentüchern durch. Erstes Waschen: 100 ml DPBS mit Kalzium (1x) in den Transferbeutel injizieren und mit den Händen mischen.
- Lassen Sie es 5 Minuten stehen und entfernen Sie den größten Teil der Basalflüssigkeit, die ausfällt.
- Entsorgen Sie die Basalflüssigkeit mit einer 60-ml-Spritze, die am Beuteladapter befestigt ist. Dieser Vorgang muss zweimal wiederholt werden.
- 100 ml Aufschlusslösung in den Beutel geben (93 ml kalziumfreies DPBS + 60 μL Calciumchlorid (1 g/L) + 7 ml 0,075% sterile Kollagenase, siehe Materialtabelle) und 30 min bei 37 °C unter langsamem Rühren stehen lassen.
- Der gesamte Inhalt des Beutels wird in vier konische Röhrchen von 50 ml umgefüllt und bei 400 x g bei 22 °C für 10 min zentrifugiert.
- Entfernen und verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie dem Zellpellet 5 ml Sulbeccos modifizierte Eagle's Medium (DMEM) niedrige Glukose hinzu, ergänzt mit 20% FBS (Fetal Rinderserum) (Abbildung 1).
3. Zählen der SVF-Zellen
- Eine frische Lösung von 10 μL Trypanblau bei 0,05% in destilliertem Wasser mit 10 μL Zellsuspension für 5 min mischen.
- Zählen Sie lebensfähige Zellen in einer Neubauer-Zellzählkammer32 mit einem Inverslichtmikroskop (siehe Materialtabelle) bei 20-facher Vergrößerung.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem kryoprotektiven Medium (5 ml FBS + 10% Dimethylsulfoxid - DMSO) in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml.
- Geben Sie 1 ml dieser Mischung in Kryoeinheiten. Verwenden Sie einen Gefrierbehälter (siehe Materialtabelle) mit einer Abkühlgeschwindigkeit von (1 °C/min bis -80 °C).
- Bei -80 °C 1 Jahr lagern.
- Nach dieser Zeit in Standard-Kassettenboxen lagern, die in die flüssige Stickstoffdampfphase (-165 °C) eingetaucht sind.
4. Auftauprozess der Zellen
- Nehmen Sie die Durchstechflaschen aus flüssigem Stickstoff und legen Sie sie sofort für 1 min in das 37 °C warme Wasserbad.
- Legen Sie die SVF-Zellen in ein konisches Röhrchen mit 4 mL DMEM (niedrige Glukose ergänzt mit 20% FBS), vorgeheizt bei 37 °C.
- Zentrifugieren bei 400 x g bei 22 °C für 5 min.
- Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml DMEM (niedrige Glukose) + 10% FBS hinzu. Führen Sie eine Immunphänotypisierung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
5. Durchflusszytometrie-Technik (Immunphänotyp-Mehrfachmarkierung)
- 1 ml Zellpellet (Konzentration von 1.000 Zellen/μL) in fünf Zytometrieröhrchen (je 200 μL) geben.
- Bei 400 x g bei 22 °C 5 min zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen.
- 300 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (10x) zugeben, bei 400 x g bei 22 °C zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette verwerfen.
- Bereiten Sie fünf Röhrchen für verschiedene Markerkombinationen wie folgt vor: 5 μL CD11B/5 μL CD19/20 μL CD45; 5 μL CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45; Zelllebensfähigkeitstest-5 μL fluoreszierender Reaktivfarbstoff. (siehe Materialtabelle) und ein Röhrchen mit ungefärbten Zellen und PBS als Negativkontrolle. Im Wirbel homogenisieren und 30 min bei 4 °C inkubieren.
- Bei 400 x g bei 22 °C 5 min zentrifugieren, den Überstand mit einer Pipette verwerfen, 500 μL PBS (10x) hinzufügen und mit der Zellsortierung fortfahren.
HINWEIS: Fünftausend Ereignisse werden pro Antikörpersatz im Durchflusszytometer mit vier Farben und fünf Parametern erfasst und mit der CellQuest-Software analysiert.
- Bei 400 x g bei 22 °C 5 min zentrifugieren, den Überstand mit einer Pipette verwerfen, 500 μL PBS (10x) hinzufügen und mit der Zellsortierung fortfahren.
6. Aussaat von Passage 1 (P1)
- Aussaat 2 x 105 Zellen in einem 75 cm2 Kulturkolben.
- Fügen Sie 12 ml DMEM niedrige Glukose + 20% FBS + 10% Antibiotikum / Antimykotikum (mit 10.000 Einheiten Penicillin, 10 mg Streptomycin und 25 μg Amphotericin B pro ml, 0,1 μm) hinzu.
- Wenn die Zellen zwischen 80% -90% Konfluenz erreichen, führen Sie eine Trypsinisierung der adhärenten Zellen mit 2 ml 0,25% EDTA-Trypsin für 3 min durch.
- Zählen Sie die Zellen erneut (wie in Schritt 3 erwähnt).
- Führen Sie die Immunphänotypisierung erneut durch (wie in Schritt 5 erwähnt).
7. Statistische Auswertung
- Verwenden Sie Spearmans Rho-Rechner33 , um die Stärke der Assoziation zwischen den folgenden Variablen mit P < 0,05 zu messen, wie unten erwähnt.
- Wählen Sie die SVF-Zellausbeute und die Anzahl der Tage, die SVF in Kultur in der ersten Passage (P1) bis 80%-90% Konfluenz (Tage bis P1) verbleibt.
- Wählen Sie SVF-Zellertrag vor und nach dem Wechsel zu P1.
- Berücksichtigen Sie Tage bis P1 und Zellertrag, bevor Sie zu P1 gehen.
- Wählen Sie SVF-Mobilfunkausbeute mit dem durchschnittlichen Prozentsatz der bestätigten ADSC.
- Berechnen Sie den Prozentsatz der bestätigten ADSC und die zelluläre Ausbeute, bevor Sie zu P1 gehen.
- Bestimmen Sie die BMI- und SVF-Zellausbeute.
8. Differenzierungstest
- Führen Sie den Differenzierungstest nach einem Differenzierungskit-Protokoll durch (siehe Materialtabelle). Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse für Fall 1.
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Representative Results
Die Charakterisierung der neun untersuchten Personen, einschließlich Alter, Gewicht, Größe und BMI, ist in Tabelle 1 dargestellt.
Entsprechend der anfänglich dargestellten Zellausbeute wurde das in Kultur inokulierte Zellvolumen so berechnet, dass es so nah wie möglich an der Kapazität des 75cm2 Kulturkolbens liegt. Das jeweils ausgesäte Probenvolumen ist in Tabelle 2 beschrieben. Dann wurde entsprechend der anfänglichen Zellausbeute ein variables Zellvolumen für jede Probe bestimmt: 1 ml für Proben mit höherer zellulärer Ausbeute, 1,1 ml für Proben mit mittlerer Zellausbeute und 2 ml für Proben mit geringerer Zellausbeute, um eine ähnlichere Zellaussaat zwischen den Fällen durchzuführen. Wenn die Kultur etwa 80%-90% Konfluenz erreichte (Abbildung 2A) (ca. 7,5 ± 4,5 Tage), wurde eine Trypsinisierung von adhärenten Zellen durchgeführt (Tabelle 2 und Abbildung 2B).
Die zelluläre Ausbeute vor Passage 1 variierte stark, selbst wenn der gleiche Zusammenfluss vor der Trypsinisierung beobachtet wurde (Tabelle 2). Dies kann durch die Tatsache erklärt werden, dass Zellen in Schichten gewachsen sein können. Verschiedene Parameter aus dem ADSC der Patienten wurden ebenfalls zu verschiedenen Zeitpunkten bewertet, wie in Tabelle 2 gezeigt.
Einige Proben (Fall 1, Fall 2, Fall 7) konnten aufgrund von Bakterienkontamination und Mangel an verfügbaren Zellen für die Durchführung einer kryokonservierten SVF-Immunphänotypisierung nicht hinsichtlich des Prozentsatzes der bestätigten ADSC und der geschätzten Anzahl von ADSC in Kultur bewertet werden. Nach dem Spearman's Rho Calculator 33 wurden keine statistischen Unterschiede zwischen der SVF-Zellausbeute und Tagen bis P1 (r = 0,37816, p = 0,31561), zwischen der SVF-Zellausbeute vor und nach dem Wechsel zu P1 (r = -0,33333, p = 0,38071) und zwischen Tagen bis P1 und zellulärer Ausbeute vor dem Übergang zu P1 (r = -0,53783, p = 0,13529). Darüber hinaus wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet, wenn die SVF-Zellausbeute mit dem durchschnittlichen Prozentsatz der bestätigten ADSC (r = -0,02857, p = 0,95716) und zwischen dem durchschnittlichen Prozentsatz der bestätigten ADSC und der zellulären Ausbeute vor dem Übergang zu P1 (r = 0,42857, p = 0,3965) korreliert wurde. Auch die Korrelation zwischen BMI und SVF-Zellertrag konnte nicht als statistisch signifikant angesehen werden (r = -0,46667, p = 0,20539). Tabelle 3 zeigt durchflusszytometrische Daten, die an kryokonservierten SVF-Zellen durchgeführt wurden. Die ursprünglichen SVF-Zellen enthielten eine Untergruppe positiver Zellen für hämatopoetische Marker (CD45, CD11b, CD19, HLA-DR)34. Aus der anfänglichen SVF-Zellpopulation exprimierte eine bestimmte Untergruppe CD11b 34 und CD1934 Stromazell-assoziierte Marker. Die Werte von CD73 34, CD90 34 und CD10534 lagen zwischen diesen Werten. Die anfängliche SVF enthielt eine Subpopulation von Zellen, die positiv für Stammzell-assoziierte Marker waren (Abbildung 3). Ein Mittelwert von 79% der SVFs exprimierte den HSC-assoziierten Marker CD3434.
Insgesamt waren 21 min für die drei Waschgänge, 30 min für die Kollagenase-Verdauung, 10 min für die Zentrifugation und 5 min für die Zellzählung und -beschichtung erforderlich.
Abbildung 1: Schritte aus dem Protokoll zur Isolierung von Stammzellen aus Fettgeweben . (A) Beutel für den Transport von Lipoaspiraten in einem geschlossenen System. (B) Der Schritt des Ruhebeutels wird nach dem Waschen dreimal wiederholt. (C) Lipoaspirate nach drei Wäschen mit DPBS. (D) Lipoaspirate nach Kollagenaseverdauung. (E) Lipoaspirate nach der Verdauung wird in einem 50-ml-Röhrchen verteilt. (F) Verdautes Lipoaspirate nach Zentrifugation. (G) Endprozessisolierung mit dem Pellet mit der stromalen Gefäßfraktion (SVF). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Morphologie und Lebensfähigkeit von ADSCs . (A) Plastisch adhärente mesenchymale Fettstammzellen am ersten Durchgang nach Isolierung bei der Lichtmikroskopie. Die Zellen zeigen eine Adhäsion an der plastischen und fibroblastenartigen Morphologie. (B) Trypanblau-Assay zeigt lebensfähige Zellen, die in der Neubauer-Kammer mit einem Lichtmikroskop gezählt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Subpopulation von Zellen, die positiv für Stammzell-assoziierte Marker in SVF von Fall 9 nach 8 Monaten Kryokonservierung sind. R1: Gesamtzellregion, analysiert in FSC (Forward Scatter) x SSC (Side Scatter) (Größe x Komplexität); R2: CD45-negative Region, deren Populationen CD73, CD90 und CD105 in dieser Region positiv sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Differenzierungstest . (A) ADSC-Differenzierung in Chondrozyten. (B) ADSC-Differenzierung in Osteozyten. (C) ADSC-Differenzierung in Adipozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Geduldig | Alter bei Abholung (Jahre) | Gewicht (kg) | Höhe (Meter) | BMI* |
| Fall 1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| Fall 2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| Fall 3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| Fall 4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| Fall 5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| Fall 6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| Fall 7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| Fall 8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| Fall 9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
Tabelle 1: Daten aus den Stichproben der untersuchten Personen. *BMI: Body-Mass-Index.
| Geduldig | Gesammeltes Volumen (ml) | SVF Zellausbeute (Zelle/ml) (x 105) | Volumen in Kultur (ml) | Durchschnittlicher Prozentsatz der bestätigten ADSC (%) | Anzahl der Zellen in der Anfangskultur (x 105) | Geschätzte Anzahl von ADSC in Kultur (x 105) | Tage bis P1 | Zellertrag vor dem Wechsel zu P1 (x 105) |
| Fall 1 | 96 | 9.2 | 2 | Na | 18.4 | Na | 10 | 18 |
| Fall 2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| Fall 3 | 100 | 26.2 | 1 | Na | 26.2 | Na | 12 | 6.6 |
| Fall 4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| Fall 5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| Fall 6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| Fall 7 | 98 | 6.8 | 2 | Na | 13.6 | Na | 8 | 10.5 |
| Fall 8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| Fall 9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| SD | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
Tabelle 2: Daten aus verschiedenen Verfahrensschritten der neun analysierten Patienten. SVF: stromale vaskuläre Fraktion; ADSC: Stammzellen aus Fett; P1: Passage 1; NA: Daten nicht verfügbar.
| PROBE | % der ADSC BESTIMMT DURCH MONOKLONALE ANTIKÖRPER | % DER HÄMATOPOETISCHEN ZELLEN, DIE DURCH MONOKLONALE ANTIKÖRPER BESTIMMT WERDEN | ZELLLEBENSFÄHIGKEITSTEST UND ZEITPUNKT DER SVF-KRYOKONSERVIERUNG | |||||||||
| CD45-(*) | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | Bedeuten | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b+ | CD19+ | LEBEND/TOT + | |||
| Fall 2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39,54% (2 Jahre) | ||
| Fall 4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38,30% (2 Jahre) | ||
| Fall 5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23,06% (2 Jahre) | ||
| Fall 6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56,76% (2 Jahre) | ||
| Fall 8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55,56% (1 Jahr) | ||
| Fall 9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72,34% (8 Monate) | ||
Tabelle 3: Durchflusszytometriedaten von sechs der Patienten. (*) Aus diesen CD45-Zellen wurde % ADSC mit verschiedenen Kombinationen von Stammzellmarkern bestimmt. ADSC: Stammzellen aus Fett; SVF: stromale vaskuläre Fraktion; (*) Aus diesen CD45-Zellen wurde % ADSC mit verschiedenen Kombinationen von Stammzellmarkern bestimmt.
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Discussion
Isolationsausbeute
Es ist allgemein bekannt, dass der Kryokonservierungsprozess, der häufig in der Zelltherapie erforderlich ist, zu einem signifikanten Zellverlust führt, manchmal mehr als 50%29,30,35. Daher ist eine technische Verbesserung zur Erzielung einer hohen anfänglichen Zellausbeute in Isolation von grundlegender Bedeutung. Die Sammelmethode der Lipoaspirate und die Isolierungsmethode der Zellen müssen sich darauf konzentrieren, eine größere Anzahl von Zellen zu erhalten, eine hohe Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten und die maximale Anzahl von Zellen aus dem Ausgangsmaterial zu extrahieren, während die langfristige Kultur und Manipulation der Zellen berücksichtigt wird. Daher ist eine direkte Kulturpflege erforderlich, um die Zellen von Apoptose, Seneszenz oder genetischer Instabilität fernzuhalten, da die Zelltherapie für Patienten wahrscheinlich wirksam und sicher ist.
Nach unserem besten Wissen gibt es keinen früheren Artikel, der diese Reihe von Schritten zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus Lipoaspirate verwendet, was zu einer zeitsparenden und kostengünstigen Technik führt. In dieser Studie wurde jeder methodische Schritt anhand der Literatur begründet, die die höchste endgültige Zellausbeute in der zellulären Isolierung zeigte. Die Neuheit der in dieser Studie durchgeführten Technik war die Verwendung einer manuellen Aspiration in Verbindung mit einer Reihe von Lipoaspirate-Waschungen, wobei der nachfolgende Beutel ruhte. Der Auffangbeutel, der zum Transport und zur Verarbeitung von Lipoaspirate verwendet wurde, ermöglichte es unverdauten Gewebefragmenten, nicht an der Kollagenaseverdauung teilzunehmen. Der kritischste Schritt ist die Zugabe von Calciumchlorid zur frischen Verdauungslösung, da es die Wirkung der Kollagenase potenziert. Der Zeitgewinn wird in der Literatur noch nicht mit einer Zellauftaumethode berichtet, die lebensfähige Zellen auch nach langer Kryokonservierungszeit ermöglicht. Die in dieser Studie gefundene SVF-Zellausbeute variierte stark von 6,15 bis 26,2 x 10 5 Zellen / ml mit einem Durchschnitt von 15,7 x 105 Zellen / ml. Dies kann auf das Vorhandensein einer signifikanteren Menge an abgesaugter Adrenalinlösung zurückzuführen sein, die je nach Stadium des chirurgischen Eingriffs und Anzahl anderer bekannter Zelltypen, die im Allgemeinen im SVF gefunden werden, höher oder niedriger gewesen sein kann. Obwohl einige Studien negative Korrelationen zwischen BMI und ADSC-Ausbeute 36,37 gefunden haben, fand diese Studie keine signifikante Korrelation, wie die anderen beiden Studien38,39, was die Möglichkeit verringert, dass dies die Ursache für die unglaubliche Vielfalt der SVF-Zellausbeute ist, die in dieser Studie gefunden wurde. Diese Daten zeigen, dass die niedrigste SVF-Zellausbeute 6,15 x 105 Zellen / ml betrug. Einige Studien hatten bereits die Effizienz der ADSC-Isolierung nach der chirurgischen Technik zur Gewinnung von Lipoaspirate gemessen. Eine Studie erhielt 0,087 x 10 5 Zellen / ml in frisch isoliertem SVF für die Fettabsaugungstechnik mit Adrenalinlösung (wie in dieser Studie verwendet) und 0,143 x 105 Zellen / ml ohne26. Diese Arbeit unterstrich die Bedeutung der Adrenalinlösungsinjektion aufgrund der vasokonstriktiven Wirkung, die intraoperative Blutungen und Blutergüsse verringert, wie die Mehrheit der Chirurgen in der klinischen Praxis durchführt. Eine weitere Studie zeigte, dass isolierte lebende ADSCs zwischen 0 und 0,59 x 10 5 Zellen/g Lipoaspirate lagen, mit einem Durchschnitt von 0,295 (±0,25) x 105 Zellen/g Gewebe31. Einige Studien haben verschiedene Wege getestet, um eine höhere ADSC-Ausbeute zu erzielen. Eine dieser Studien erreichte etwa 350 x 105 für die Methode, die verschiedene Bestandteile im Kollagenase-Verdauungspuffer und die Verwendung eines Orbitalschüttlers40 präsentierte. Eine weitere Studie zeigte 29,7 (±0,2) x 105 Zellen / ml als Gesamtzahl der SVF-Zellen aus dem Bauchbereich41. Der in dieser Studie gewählte Bauchbereich ist nach wie vor der Referenzbereich für die beste Verfügbarkeit und Zugänglichkeit von Lipoaspirate42. Die Körperregion für die Lipoaspiratenentnahme, neben anderen Faktoren wie Spenderalter und Methode der gewählten Sammlung, ist ein starker Determinant für die Qualität der ADSC-Erträge.
Die Möglichkeit, dass die Kontamination von Mikroorganismen dazu führte, dass Zellen nicht mehr zur Verfügung standen, um die Experimente fortzusetzen, war das einzige Ausführungsproblem, das den Abschluss dieser Studie einschränkte. Selbst unter Verwendung von Antibiotika und Anforderungen der Good Manufacturing Practice kann es aufgrund des Fehlens einer vollständigen aseptischen Umgebung zur Absaugung von Fett zu einer Kontamination kommen.
SVF-Immunphänotypisierung
Nach Angaben des Mesenchymal- und Gewebestammzellkomitees der Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie 34 ist eines der drei Mindestkriterien zur Definition menschlicher mesenchymaler Stammzellen, dass die Zellen CD105 34, CD73 34 und CD90 34 exprimieren müssen und CD45 34, CD34 34, CD14 34 oder CD11b 34, CD79a 34 oder CD19 34 nicht exprimieren sollten. und HLA-DR34 Oberflächenmembranmoleküle. Mitchell43 testete frische SVF-Zellen durch Immunphänotypisierung und fand maximal 54% der Zellen mit ADSC-Oberflächenmarkern. In dieser Studie ergab die Immunphänotypisierung einen höheren Prozentsatz an bestätigten ADSC (nicht-hämatopoetischen Zellen) von bis zu 78,91% in der SVF nach Langzeitkryokonservierung (im Bereich von 37,95%-78,91% mit einem Mittelwert von 53,68%). Es gibt Hinweise darauf, dass die Vorläufer einer noch nicht gebundenen Stammzellpopulation den CD34-Marker34,44,45 nicht exprimieren. Je nach Differenzierungsstadium können die CD3434-negativen Stammzellen nicht nur hämatopoetische Vorläuferzellen erzeugen, sondern auch spezifischere mesenchymale Vorläufer wie Osteoklasten, Chondrozyten, Myozyten, Adipozyten und andere. Einige Studien zeigten die auffallende Plastizität der primitiven Stammzellpopulation, die aus Zellen mit Stromazellfunktion und hämatopoetischen und mesenchymalen Vorläuferzellen besteht45. Nach der Literatur ist die vollständige funktionelle Rolle von CD3434 bei der Gewebebildung in SVF-Zellen noch unbekannt46. Mitchell43 zeigte einen Mittelwert von 60% SVF-Zellen mit CD3434-Marker, während in dieser Studie der Mittelwert 78,81% betrug. Es ist bekannt, dass die Expression des CD3434-Oberflächenmarkers entlang von Passagen abnimmt.
Adhärente Zellen und Differenzierungsassay
Abhängig von der Anzahl der nach der Isolierung erhaltenen Zellen variierte die Anzahl der in der ersten Kultur ausgesäten Zellen. Die erste Kulturzeit zum Erreichen einer Konfluenz von 80%-90% in 75 cm2 Kolben dauerte durchschnittlich 8,4 Tage und eine Standardabweichung von 7,5 (±4,5) Tagen im Bereich von 6,6 bis 16,1 x 105 Zellen / ml. Es ist anzumerken, dass selbst für die Fälle mit geringerer Zellausbeute die erste Kulturzeit im Vergleich zur Literatur zu hohen zellulären Ertragsindizes führte, wahrscheinlich aufgrund der besten Verfügbarkeit lebensfähiger Zellen, die während des gesamten Entnahme- und Isolierungsprozesses aufrechterhalten wurden. Eine Studie erhielt eine zelluläre Ausbeute von 3,75 (±1,42) x 105 ADSC pro ml Lipoaspirate innerhalb einer Kulturperiode von 4,1 (±0,7) Tagen47. Eine weitere Studie zeigte eine Ausbeute an kernhaltigen SVF-Zellen von 3,08 (±1,40) x 105 pro Millimeter mit einem Mittelwert von 6,0 (±2,4) Tagen in der ersten Kulturperiode43. In dieser Studie wurde durch Schätzung der Anzahl der in Kultur gesäten ADSC-Samen, die in Abhängigkeit von der Anzahl der im SVF beobachteten Zellen aus der Entnahme des gleichen Volumens von 100 ml Lipoaspirate variierte, bestätigt, dass die Anzahl der Tage, die P1 erreichten, in keinem Zusammenhang mit dem Zellvolumen stand. Zum Beispiel waren für Fall 9, in dem 12,2 x 105 Zellen inkubiert wurden, 6 Tage erforderlich, um 80% -90% Konfluenz zu erreichen. Für Fall 6, in dem 14,6 x 105 Zellen in Kultur ausgesät wurden, war ein längerer Zeitraum (10 Tage) erforderlich, um den gleichen Konfluenzgrad zu erreichen. Vielleicht reicht eine minimale ADSC-Anzahl für die erste Adhäsionsperiode. Es kann signifikante interindividuelle Unterschiede geben, wie Komorbiditäten, Alter und allgemeiner Gesundheitszustand. Einige Studien in der Literatur stellten die Bedeutung der Berücksichtigung der interindividuellen Variabilität der Patienten für die SVF-Zellausbeutein Frage 48,49.
Laut dem Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee der International Society for Cellular Therapy34 müssen mesenchymale Zellen die Fähigkeit haben, sich in drei verschiedene Zelltypen als osteogene, adipogene und chondrogene Linien zu differenzieren, wie in Abbildung 4 gezeigt wurde.
Zelllebensfähigkeit, Kryokonservierung und genetische Instabilität
Verschiedene Methoden wurden verwendet, um den Lebensfähigkeitsverlust zu bestimmen, definiert als Schadenersatz der Plasmamembranintegrität50. Die Kulturen können jedoch auch frühe apoptotische Zellen präsentieren, die diese Ansätze ignorieren können, weil sie eine intakte Plasmamembran aufrechterhalten, aber sie sind nicht lebensfähig. Die hier berichteten Ergebnisse zeigen eine große Bandbreite an Lebensfähigkeitsmarkern von 23,06% bis 72,34% mit einem Mittelwert von 47,6% nach langfristiger Kryokonservierung. In Anbetracht der Tatsache, dass die Kryokonservierung ein bedeutender Schritt in der Zelltherapie ist, ist die Wiederherstellung der maximalen Anzahl lebensfähiger und funktionsfähiger Stammzellen nach dem Auftauen eines der vorrangigen Themen für den Erfolg der Zelltherapie. Die Literatur hat gezeigt, dass mindestens 50% der Zelllebensfähigkeit 1-4 Monate nach der Kryokonservierung verloren gehen43. Bemerkenswerterweise stammen die niedrigsten Indizes in dieser Studie aus Fall 5, Fall 4 und Fall 2, den ältesten kryokonservierten Proben (etwa 2 Jahre). Obwohl sie die niedrigsten Lebensfähigkeitsindizes aufwiesen, zeigten sie eine hohe zelluläre Ausbeute im Trypanblau-Farbstoffausschlusstest in frischem SVF. Obwohl die Literatur Ursachen für Lebensfähigkeitsverlust unterstützt, sind diese Raten niedriger als erwartet. Temperaturschwankungen in der Zelllagerung aus technischen Gründen können die Zunahme und Akkumulation von Stress verursachen und die Ansammlung von wässrigen Anteilen begünstigen, wodurch Kristalle entstehen, die die plasmatische Membran während der Langzeitkryokonservierung schädigen51. Die Literatur zeigt eine Lebensfähigkeit von mehr als 70% für Proben mit gleicher oder längerer Gefrierzeit. Die Rentabilitätsprüfung wurde jedoch mit einer anderen Technik als in dieser Studie durchgeführt52. Eine weitere Studie zeigte, dass eine längere Kryokonservierung die zelluläre Lebensfähigkeitnegativ beeinflusst 31, was durch Temperaturschwankungen im Gefrierschrank von -80 °C erklärt werden kann. Daher müssen Zellen oft zu lange in Kultur bleiben, was den Stress des Zellzyklus erhöht, Risiken für genetische Instabilität birgt und folglich die Zelltherapie beeinträchtigt. Es gibt auch einen Konsens in der Literatur, der auf einige Stressfaktoren hinweist und wie sie die zytogenetische Stabilität der Zellen beeinflussen, die für die Aufrechterhaltung der für die Zelltherapie erforderlichen verlängerten Stammzellkultivierung unerlässlich ist35,53.
Nutzen der Methodik
Bis heute zeigt die Literatur kein standardisiertes Protokoll zur Isolierung von ADSC für klinische Anwendungen. Die meisten Studien zeigen komplexe, zeitaufwändige Protokolle24. In dieser Studie muss die Effizienz der Methode im Vergleich zur Zeit, die benötigt wird, um die anfängliche Zellausbeute zu vervollständigen, hervorgehoben werden: etwa 1,5 h. Laut Literatur kann die Isolierung von Fettstammzellen etwa 3 h bis 8 h dauern54,55. Daher ist der Zeitgewinn in Verbindung mit dem hohen Zelleinkommen entscheidend für die Weiterentwicklung der Therapeutika der regenerativen Medizin. Zur Verbesserung dieser Methode sollten parallel zu den in dieser Arbeit durchgeführten Bewertungen der Zelllebensfähigkeit weitere Bewertungen durchgeführt werden. Weitere randomisierte kontrollierte Studien mit einer umfangreicheren Stichprobe unter Verwendung dieser Methodik sind erforderlich, um diese Ergebnisse gegenzuzeichnen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken den Patienten, die sich freiwillig zur Teilnahme gemeldet haben, und dem medizinischen und pflegerischen Personal des Krankenhauses São Paulo. Diese Studie wurde von der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) und Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasilien, unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
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