JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

脂肪組織から間葉系幹細胞を得る技術および長期凍結保存における間質血管画分のキャラクタリゼーション

Published: December 30, 2021
doi:
10.3791/63036
, , , , , , ,
1Genetics Division,Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2TechLife Biotech,São Lucas Cell Therapy Group, 3Division of Plastic Surgery,Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

Summary

本プロトコルは、文献と比較して時間的増加を伴う途方もない細胞収量をもたらすADSC単離のための改良された方法論を記載する。この研究はまた、長期凍結保存後に比較的多数の生細胞を得るための簡単な方法を提供します。

Abstract

脂肪組織由来のヒト間葉系幹細胞は、適切な特徴を示し、再生臨床応用のためのアクセス可能な供給源であるため、ますます魅力的になっています。脂肪由来幹細胞を得るために、異なるプロトコルが使用されている。この記事では、より大量のADSCを得るために改良された時間節約プロトコルのさまざまなステップについて説明し、ADSCを凍結保存および解凍して培養増殖用の生細胞を取得する方法を示します。その後待機的腹部形成術を受けた9人の患者の腹部から、26cmの3穴および3mm口径のシリンジ脂肪吸引を使用して、100ミリリットルの脂肪吸引液を採取した。幹細胞の単離は、カルシウムを添加したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)溶液およびコラゲナーゼの使用による一連の洗浄で行った。間質血管画分(SVF)細胞を凍結保存し、その生存率をイムノフェノタイピングによって確認しました。SVF細胞収量は15.7 x 105 細胞/ mLであり、6.1〜26.2細胞/ mLの範囲でした。接着性SVF細胞は平均7.5(±4.5)日後にコンフルエントに達し、平均細胞収量は12.3(± 5.7)x 105 細胞/mLでした。8ヶ月、1年、2年後の解凍SVFの生存率は23.06%〜72.34%の範囲で、平均47.7%(±24.64)であり、2年間の凍結の場合と相関する生存率は最も低かった。カルシウムとバッグの休止時間を補ったDPBS溶液を使用して脂肪を沈殿させ、コラゲナーゼ消化時間を短縮すると、幹細胞の最終細胞収量が増加しました。生幹細胞を高収率で得るための詳細な手順は、以前の研究の技術よりも時間と細胞収率に関してより効率的でした。長期間の凍結保存後でも、SVFに生菌ADSC細胞が見出された。

Introduction

ヒト間葉系幹細胞は、基礎研究と応用研究の両方で有利です。この成体細胞型の使用は、胚や他の細胞の使用と比較して倫理的問題を克服し、腫瘍領域、変性疾患の治療、再建手術領域2,3,4の治療など、自家組織再生工学および細胞治療における最も有望な研究分野の1つです。5.脂肪組織の間質血管細胞画分には間葉系多能性および多能性幹細胞の豊富な供給源があることが以前に報告されている6,7。これらのADSCは、最小限の侵襲的手順から、ex vivoでの強力な増殖能力を有するかなりの数の細胞を高収率で容易に得ることができるため、細胞療法および移植/注入に使用するための優れた候補と考えられている5,8。

また、脂肪組織は、他の2つの供給源(骨髄および臍帯組織)よりも間葉系幹細胞を提供する能力が高いことも実証されました9。ADSCは、免疫原性が低く、宿主組織に統合し、周囲の組織と相互作用する能力が高いことに加えて4,10、細胞株への分化の多能性能力を有し、適切な培養条件下での軟骨形成、骨形成、および筋原性分化の報告があります11,12,13、および膵臓、肝細胞などの細胞への分化、 神経原性細胞14,15,16。

科学界は、間葉系幹細胞の免疫調節効果が、その分化特性よりも細胞療法にとってより関連性のある作用機序であることに同意しています17,18,19。ADSC使用の最も重要なメリットの1つは、自家注入または移植の可能性であり、いくつかの疾患の代替治療になります。再生医療では、肝障害、心筋の再建、神経組織の再生、骨格筋機能の改善、骨の再生、がん治療、糖尿病治療などにADSCがすでに使用されています20,21。

現在までに、ADSCの可能性を評価するための263の登録臨床試験があり、米国国立衛生研究所のウェブサイトに記載されています22。脂肪組織を採取するためのさまざまなプロトコルが確立されていますが、臨床使用のためにADSCを分離するための標準化された方法についての文献にはコンセンサスがありません23,24。手術中および手術後の脂肪吸引処理方法は、細胞生存率、最終的な細胞収量25、およびADSC集団の質20に直接影響する可能性があります。外科的前処理に関しては、どの外科的前処理技術が単離後により多くの有意な数の生細胞を生成するか、または脂肪組織に注入された麻酔薬溶液が細胞収量およびその機能に影響を与えるかどうかは十分に確立されていない26。同様に、脂肪細胞を得るための技術間の違いは、生存可能なADSC20の数の70%もの減少をもたらし得る。文献によれば、超音波を含む高い生存率を有する細胞集団を得るための機械的処置は、脂肪組織を分解する可能性があるため、避けるべきである20。ただし、注射器を使用した手動脂肪吸引法は害が少なく、細胞破壊が少なく、腫脹性脂肪吸引により、最高品質のかなりの数の細胞が得られます26。

この技術は、脂肪吸引領域に注入されるリドカインとエピネフリンを含む生理食塩水を使用します。注入された溶液の容量3 mLごとに、1 mLが吸引されます。この研究では、1 mLのアドレナリンと生理食塩水を注入するごとに、0.2 mLの脂肪組織を吸引する湿式脂肪吸引技術を実施しました。消化酵素、特にコラゲナーゼの使用は、ADSCを単離するプロセスに一般的です。

実験室での最初の単離ステップの後、最終的なペレットは間質血管画分(SVF)と呼ばれます。これには、内皮前駆細胞、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞、リンパ球、周皮細胞、前脂肪細胞、および接着が可能なADSCを含む、さまざまな細胞タイプ27が含まれています。 in vitro 培養からの最終的な単離が完了すると、プラスチックに接着しなかった細胞は培地交換で排除されます。8週間の増殖、培地交換、および継代の後、ADSCはフラスコ20内の細胞集団の大部分を表す。将来の治療の可能性のために単離された脂肪由来幹細胞を使用することの最も重要な利点の1つは、凍結保存の可能性です。凍結保存された脂肪吸引液は、6週間の凍結後でもSVF細胞の潜在的な供給源であり28、2年間の凍結保存後でも生物学的活性があり29、培養で増殖および分化する完全な能力があることが実証されました30。しかしながら、融解プロセス中に、かなりの割合の細胞が通常失われる31。したがって、脂肪吸引除去プロセスおよび以下の細胞単離方法は、最高の細胞収率を確保しなければならない。

この研究では、ADSCを収集して分離するためのより迅速な方法論について説明し、細胞治療の効率を向上させるための高い細胞収量と生存率を実証します。さらに、SVF凍結保存後のこの改良技術の効果を評価した。

Protocol

本研究は、UNIFESPの倫理委員会(プロトコル番号:0029/2015 CAAE:40846215.0.0000.5505)によって承認され、 ヘルシンキ宣言(2004)に従って患者から書面によるインフォームドコンセントを取得した後に実施されます。本研究のサンプルは、33〜50歳(平均年齢41.5歳)および平均初期ボディマス指数(BMI)24.54(22.32〜26.77の範囲)(表1)の9人の女性患者で構成されています 妊娠後の皮膚の過剰のために審美…

Representative Results

年齢、体重、身長、BMIなど、調査した9人の個人の特徴を 表1に示します。 最初に提示した細胞収量に従って、培養液に接種される細胞量は、75cm2 培養フラスコの容量にできるだけ近いと計算した。それぞれの場合において播種したサンプル量を 表2に記載する。次に、初期細胞収量に従って、各サンプルの可変容量の細胞を決定しました…

Discussion

単離収率
細胞療法で頻繁に必要とされる凍結保存プロセスは、時には50%を超える重大な細胞損失をもたらすことは十分に確立されています29,30,35。したがって、単離して高い初期細胞収量を得るための技術的改善が基本である。脂肪吸引液の採取方法と細胞の単離方法は、細胞の長期培養と操作を考慮しな?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ボランティアで参加してくださった患者さん、サンパウロ病院の医療・看護スタッフに感謝します。この研究は、サンパウロ州アンパロ・ペスキサ・ド・エスタード・デ・サンパウロ財団(FAPESP)およびブラジルのコンセリョ・ナシオナル・デ・デセンボルビメント・シエンティフィコ・エ・テクノロヒコ(CNPq)の支援を受けた。

Materials

1.8 mL cryovials Nunc Thermo Fisher Scientific 340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag JP FARMA 80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 Sigma Aldrich A5533
Adrenaline (1 mg/mL) Hipolabor NA
Alcian Blue solution Sigma Aldrich 1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x Gibco 15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis BD BioSciences NA
Calcium chloride 10% Merck 102379
Chlorhexidine gluconate 4% VIC PHARMA NA
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) Gibco 11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) Gibco A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) Gibco A1285601
Fetal bovine serum Gibco 10500056
Formaldehyde 4% Sigma Aldrich 1,00,496
Inverted light microscope Nikon Eclipse TS100 NA
Live and Dead Cell Assay Thermofisher 01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105 BD BioSciences 745927
Monoclonal antibody: CD11B BD BioSciences 746004
Monoclonal antibody: CD19 BD BioSciences 745907
Monoclonal antibody: CD34 BD BioSciences 747822
Monoclonal antibody: CD45 DAKO M0701
Monoclonal antibody: CD73 BD BioSciences 746000
Monoclonal antibody: CD90 BD BioSciences 553011
Monoclonal antibody: HLA-DR BD BioSciences 340827
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 Gibco  10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Gibco A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Gibco A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Gibco A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site Origen Biomedical Connector, USA NA Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4% Sigma Aldrich 93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red Gibco 25200056
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  2. Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, 104-107 (2014).
  3. Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
  4. Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  5. Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
  6. Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
  7. Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
  8. Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
  9. Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
  10. Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
  11. Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
  12. Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol’Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol’Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
  13. Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
  14. Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
  15. Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
  16. Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
  17. Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
  18. Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
  19. El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
  20. Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
  21. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
  22. . US National Institutes of Health Website Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019)
  23. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
  24. Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
  25. Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
  26. Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
  27. Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
  28. Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
  29. Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
  30. Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
  31. Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
  32. Freshney, R. I. . Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , (2001).
  33. . Spearman’s Rho Calculator Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020)
  34. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  35. Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
  36. Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
  37. Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
  38. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
  39. Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
  40. Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
  41. Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
  42. Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
  43. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  44. Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
  45. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  46. Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
  47. Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
  48. Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
  49. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
  50. Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
  51. Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
  52. Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
  53. Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
  54. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).

Tags

Mesenchymal Stem CellsStromal Vascular FractionCryopreservationCell IsolationCell CharacterizationCell ViabilityCell CountingCell SuspensionCryoprotective MediumFreezing ProtocolLong-term Storage

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pola-Silva, L., Xerfan Nahas, F., Nascimento, F., Santos, T. R., Malinverni, A. M., Alves, A., Ferreira, L. M., Melaragno, M. I. Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation. J. Vis. Exp. (178), e63036, doi:10.3791/63036 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image