Summary
El presente protocolo describe una metodología mejorada para el aislamiento de ADSC que resulta en un tremendo rendimiento celular con ganancia de tiempo en comparación con la literatura. Este estudio también proporciona un método sencillo para obtener un número relativamente grande de células viables después de la criopreservación a largo plazo.
Abstract
Las células madre mesenquimales humanas derivadas del tejido adiposo se han vuelto cada vez más atractivas, ya que muestran características apropiadas y son una fuente accesible para aplicaciones clínicas regenerativas. Se han utilizado diferentes protocolos para obtener células madre derivadas de tejido adiposo. Este artículo describe diferentes pasos de un protocolo mejorado de ahorro de tiempo para obtener una cantidad más significativa de ADSC, mostrando cómo criopreservar y descongelar ADSC para obtener células viables para la expansión del cultivo. Se recolectaron cien mililitros de lipoaspirado, utilizando una liposucción de jeringa de 26 cm de tres orificios y calibre 3 mm, del área abdominal de nueve pacientes que posteriormente se sometieron a una abdominoplastia electiva. El aislamiento de células madre se llevó a cabo con una serie de lavados con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco suplementada con calcio y el uso de colagenasa. Las células de la fracción vascular estromal (SVF) fueron criopreservadas, y su viabilidad fue comprobada por inmunofenotipado. El rendimiento celular SVF fue de 15,7 x 105 células/ml, variando entre 6,1-26,2 células/ml. Las células SVF adherentes alcanzaron la confluencia después de un promedio de 7,5 (±4,5) días, con un rendimiento celular promedio de 12,3 (± 5,7) x 105 células/ml. La viabilidad de la FV descongelada después de 8 meses, 1 año y 2 años varió entre 23,06% -72,34% con un promedio de 47,7% (±24,64) con la viabilidad más baja correlacionada con casos de congelación a dos años. El uso de la solución de DPBS suplementada con calcio y tiempos de reposo de bolsas para la precipitación de grasas con un tiempo más corto de digestión de la colagenasa dio como resultado un aumento del rendimiento celular final de las células madre. El procedimiento detallado para obtener altos rendimientos de células madre viables fue más eficiente en cuanto a tiempo y rendimiento celular que las técnicas de estudios anteriores. Incluso después de un largo período de criopreservación, se encontraron células ADSC viables en el SVF.
Introduction
Las células madre mesenquimales humanas son ventajosas tanto en la investigación básica como en la aplicada. El uso de este tipo de células adultas supera las cuestiones éticas, en comparación con el uso de células embrionarias u otras, siendo una de las áreas de estudio más prometedoras en ingeniería de regeneración tisular autóloga y terapia celular1, como el área neoplásica, el tratamiento de enfermedades degenerativas y aplicaciones terapéuticas en el área de cirugía reconstructiva 2,3,4, 5. Se ha relatado previamente que existe una fuente abundante de células madre mesenquimales multipotentes y pluripotentes en la fracción de células vasculares estromales del tejido adiposo 6,7. Estos ADSC se consideran excelentes candidatos para su uso en terapia celular y trasplante/infusión, ya que un número considerable de células con una fuerte capacidad de expansión ex vivo se pueden obtener fácilmente con un alto rendimiento de un procedimiento mínimamente invasivo 5,8.
También se demostró que el tejido adiposo presenta una mayor capacidad para proporcionar células madre mesenquimales que otras dos fuentes (médula ósea y tejido del cordón umbilical)9. Además de ser poco inmunogénico y tener una alta capacidad para integrarse en el tejido huésped e interactuar con los tejidos circundantes4,10, el ADSC tiene una capacidad multipotente de diferenciación en líneas celulares, con informes de diferenciación condrogénica, osteogénica y miogénica en condiciones de cultivo apropiadas11,12,13, y en células, como pancreáticas, hepatocitos, y células neurogénicas14,15,16.
La comunidad científica está de acuerdo en que el efecto inmunomodulador de las células madre mesenquimales es un mecanismo de acción más relevante para la terapia celular17,18,19 que su propiedad de diferenciación. Uno de los méritos más significativos del uso de ADSC es la posibilidad de infusión autóloga o injerto, convirtiéndose en un tratamiento alternativo para varias enfermedades. Para la medicina regenerativa, ADSC ya han sido utilizados en casos de daño hepático, reconstrucción del músculo cardíaco, regeneración del tejido nervioso, mejora de la función del músculo esquelético, regeneración ósea, terapia del cáncer y tratamiento de la diabetes20,21.
Hasta la fecha, hay 263 ensayos clínicos registrados para la evaluación del potencial de ADSC, enumerados en el sitio web de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos22. Se han establecido diferentes protocolos para la recolección de tejido adiposo, pero no hay consenso en la literatura sobre un método estandarizado para aislar ADSC para uso clínico23,24. Los métodos de procesamiento de lipoaspirados durante y después de la cirugía pueden afectar directamente la viabilidad celular, el rendimiento celular final25 y la calidad de la población ADSC20. En cuanto al pretratamiento quirúrgico, no está bien establecido qué técnica quirúrgica de pretratamiento produce un número más significativo de células viables después del aislamiento o si la solución anestésica inyectada en el tejido adiposo afecta el rendimiento celular y sus funciones26. Del mismo modo, la diferencia entre las técnicas para obtener células adiposas puede conducir a una disminución de hasta el 70% en el número de ADSC20 viables. De acuerdo con la literatura, los tratamientos mecánicos para obtener poblaciones celulares con alta viabilidad, incluyendo ultrasonidos, deben ser evitados, ya que pueden descomponer el tejido adiposo20. Sin embargo, el método manual de aspiración de grasa con jeringas es menos dañino, causando menos destrucción celular, con liposucción tumescente produciendo un número significativo de células con la mejor calidad26.
Esta técnica utiliza una solución salina con lidocaína y epinefrina que se inyecta en el área de liposucción. Por cada volumen de 3 ml de solución inyectada, se aspira 1 ml. En este estudio, se realizó la técnica de liposucción húmeda, en la que por cada 1 mL de adrenalina y solución salina inyectada, se aspiran 0,2 mL de tejido adiposo. El uso de enzimas digestivas, especialmente colagenasa, es común para el proceso de aislamiento de ADSC.
Después del primer paso de aislamiento en el laboratorio, el pellet final se llama fracción vascular estromal (SVF). Contiene diferentes tipos de células27, incluyendo células precursoras endoteliales, células endoteliales, macrófagos, células musculares lisas, linfocitos, pericitos, preadipocitos y ADSC, que son capaces de adhesión. Una vez concluido el aislamiento final a partir de cultivos in vitro , las células que no se adhirieron al plástico se eliminan en intercambios de medios. Después de ocho semanas de expansión, cambios de medio y pasajes, las ADSC representan la mayor parte de la población celular en los frascos20. Una de las ventajas más significativas del uso de células madre aisladas derivadas de tejido adiposo para una posible terapia futura es la posibilidad de criopreservación. Se demostró que el lipoaspirado criopreservado es una fuente potencial de células SVF incluso después de 6 semanas de congelación28, con actividad biológica incluso después de 2 años de criopreservación29, y plena capacidad para crecer y diferenciarse en cultivo30. Sin embargo, durante el proceso de descongelación, un porcentaje considerable de células generalmente se pierde31. Por lo tanto, el proceso de eliminación de lipoaspirado y los siguientes métodos de aislamiento celular deben garantizar el mayor rendimiento celular.
Este estudio describe una metodología más rápida para recolectar y aislar ADSC, demostrando un alto rendimiento celular y viabilidad para una mejor eficiencia de la terapéutica celular. Además, se evaluó el efecto de esta técnica mejorada después de la criopreservación de SVF a largo plazo.
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Protocol
El presente estudio es aprobado por el Comité de Ética de la UNIFESP (número de protocolo: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), realizado después de obtener el consentimiento informado por escrito de los pacientes de acuerdo con la Declaración de Helsinki (2004). La muestra del presente estudio está compuesta por nueve pacientes del sexo femenino, con edades de 33-50 años (edad promedio 41,5) y promedio de índice de masa corporal inicial (IMC) de 24,54 (variando entre 22,32-26,77) (Tabla 1) que fueron sometidas a abdominoplastia estética por exceso de piel después del embarazo, en la División de Cirugía Plástica de la Universidad Federal de São Paulo (Unifesp), Brasil. Para reducir el sesgo, los pacientes fueron seleccionados como un grupo homogéneo considerando el sexo, la edad y el IMC. Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.
1. Recolección de lipoaspirado
NOTA: Este paso debe realizarse en el centro de cirugía.
- Use gluconato de clorhexidina al 4% (consulte la Tabla de materiales) para la preparación de la piel y la asepsia.
- Realizar una incisión cutánea subcutánea de 2 mm (entre la subdermis y la aponeurosis). Inserte una cánula Klein de 26 mm 3 G calibre tres orificios y 3 mm y una jeringa para inyectar un volumen total de 500 ml de una solución de adrenalina (1 mg/ml) (ver Tabla de materiales) diluida en solución salina (1:1.000.000) en el área infraumbilical.
- Conecte una jeringa de 60 ml a una cánula de liposucción de 26 mm 3 G de tres orificios y calibre 3 mm e insértela a través de la incisión de la piel, bloqueando el émbolo para crear un vacío.
- Realice movimientos de empuje y tracción para que, con el vacío creado, el lipoaspirado permanezca en la jeringa de 60 ml.
- Usando un conector estéril con una válvula, transfiera los 100 ml del lipoaspirado recolectado a una bolsa de transferencia de cloruro de polivinilo de 150 ml (consulte la Tabla de materiales).
- Empaque la bolsa de transferencia en una caja de poliestireno a temperatura ambiente (~ 25 ° C) y llévela inmediatamente al laboratorio. No tome más de 30 minutos para iniciar el procesamiento del tejido.
2. Procesamiento de lipoaspirado
NOTA: Este paso debe realizarse en el laboratorio.
- Primero, pese la bolsa, mida la temperatura con un termómetro clínico infrarrojo digital sin contacto y deje la bolsa reposando durante 5 minutos dentro de la cámara de flujo laminar para la precipitación de las capas más grasas (burbujas) y la separación de tejidos que contienen las células de interés.
- Realizar una serie de lavados de tejidos. Primer lavado: inyecte 100 mL de DPBS con calcio (1x) en la bolsa de transferencia y mézclelo con las manos.
- Deje reposar durante 5 minutos y retire la mayor parte del líquido basal que precipita.
- Deseche el líquido basal con una jeringa de 60 ml conectada al adaptador de bolsa. Este proceso debe repetirse dos veces.
- Añadir 100 ml de solución digestiva a la bolsa (93 ml de DPBS sin calcio + 60 μL de cloruro de calcio (1 g/L) + 7 ml de colagenasa estéril al 0,075%, ver Tabla de materiales) y dejar a 37 °C durante 30 min de agitación lenta.
- Transfiera todo el contenido de la bolsa a cuatro tubos cónicos de 50 ml y centrifugarlos a 400 x g a 22 °C durante 10 min.
- Retire y deseche el sobrenadante y agregue 5 ml de glucosa baja en el medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con FBS al 20% (suero fetal bovino) al pellet celular (Figura 1).
3. Recuento de las células SVF
- Mezclar una solución fresca de 10 μL de azul de tripano al 0,05% en agua destilada con 10 μL de suspensión celular durante 5 min.
- Cuente células viables en una cámara de recuento de célulasNeubauer 32 utilizando un microscopio de luz invertida (consulte la Tabla de materiales) con un aumento de 20x.
- Resuspender el pellet celular en un medio crioprotector (5 mL de FBS + 10% de Dimetilsulfóxido - DMSO) a una concentración de 1 x 106 células/mL.
- Coloque 1 ml de esta mezcla en crioviales. Utilice un recipiente de congelación (consulte la Tabla de materiales) con una velocidad de enfriamiento de (1 °C/min a -80 °C).
- Conservar a -80 °C durante 1 año.
- Después de este tiempo, conservar en cajas de casetes estándar sumergidas en la fase de vapor de nitrógeno líquido (-165 °C).
4. Proceso de descongelación de las células
- Retirar los viales del nitrógeno líquido y colocarlos inmediatamente en el baño maría a 37 °C durante 1 min.
- Coloque las células SVF en un tubo cónico con 4 ml de DMEM (bajo nivel de glucosa suplementado con 20% de FBS) precalentado a 37 °C.
- Centrifugar a 400 x g a 22 °C durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de DMEM (glucosa baja) + 10% FBS. Realice el inmunofenotipado siguiendo los pasos a continuación.
5. Técnica de citometría de flujo (marcaje múltiple de inmunofenotipo)
- Colocar 1 ml de pellet celular (concentración de 1.000 células/μL) en cinco tubos de citometría (200 μL cada uno).
- Centrifugar a 400 x g a 22 °C durante 5 min y desechar el sobrenadante con una pipeta.
- Añadir 300 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (10x), centrifugar a 400 x g a 22 °C y desechar el sobrenadante con una pipeta.
- Preparar cinco tubos para diferentes combinaciones de marcadores de la siguiente manera: 5 μL de CD11B/5 μL de CD19/20 μL de CD45; 5 μL de CD73/20 μL de CD90/5 μL de CD105/20 μL de CD45; 20 μL de CD34/5 μL de HLA-DR/20 μL de CD45; Ensayo de viabilidad celular-5 μL de colorante reactivo fluorescente. (ver Tabla de Materiales) y un tubo con células no teñidas y PBS como control negativo. Homogeneizar en un vórtice e incubar a 4 °C durante 30 min.
- Centrifugar a 400 x g a 22 °C durante 5 min, desechar el sobrenadante con una pipeta, añadir 500 μL de PBS (10x) y proceder a la clasificación celular.
NOTA: Se adquieren cinco mil eventos por anticuerpo establecido en el citómetro de flujo de cuatro colores y cinco parámetros y se analizan con el software CellQuest.
- Centrifugar a 400 x g a 22 °C durante 5 min, desechar el sobrenadante con una pipeta, añadir 500 μL de PBS (10x) y proceder a la clasificación celular.
6. Siembra del pasaje 1 (P1)
- Semilla 2 x 105 células en un matraz de cultivo de 75cm2 .
- Agregue 12 ml de DMEM bajo en glucosa + 20% de FBS + 10% antibiótico / antimicótico (con 10,000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina y 25 μg de anfotericina B por ml, 0.1 μm).
- Cuando las células alcancen entre 80%-90% de confluencia, realizar tripsinización de células adherentes con 2 mL de 0,25% EDTA-tripsina durante 3 min.
- Vuelva a contar las celdas (como se mencionó en el paso 3).
- Realice nuevamente el inmunofenotipado (como se mencionó en el paso 5).
7. Análisis estadístico
- Utilice la calculadora Rho33 de Spearman para medir la fuerza de asociación entre las siguientes variables con P < 0.05, como se menciona a continuación.
- Seleccione el rendimiento celular SVF y el número de días que SVF permanece en cultivo en el primer paso (P1) hasta 80%-90% de confluencia (días hasta P1).
- Seleccione el rendimiento celular SVF antes y después de pasar a P1.
- Considere los días para P1 y el rendimiento celular antes de ir a P1.
- Seleccione el rendimiento celular SVF con el porcentaje promedio de ADSC confirmado.
- Calcule el porcentaje de ADSC confirmado y el rendimiento celular antes de pasar a P1.
- Determinar el IMC y el rendimiento celular SVF.
8. Ensayo de diferenciación
- Realice el ensayo de diferenciación siguiendo un protocolo de kit de diferenciación (ver Tabla de materiales). La Figura 4 muestra los resultados para el Caso 1.
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Representative Results
La caracterización de los nueve individuos estudiados, incluyendo su edad, peso, talla e IMC, se muestra en la Tabla 1.
De acuerdo con el rendimiento celular presentado inicialmente, se calculó que el volumen celular inoculado en cultivo era lo más cercano posible a la capacidad del matraz de cultivo de 75 cm2. El volumen muestral sembrado en cada caso se describe en la Tabla 2. Luego, de acuerdo con el rendimiento celular inicial, se determinó un volumen variable de células para cada muestra: 1 mL para muestras con mayor rendimiento celular, 1.1 mL para muestras con rendimiento celular intermedio y 2 mL para muestras con menor rendimiento celular para realizar una siembra celular más similar entre casos. Cuando el cultivo alcanzó alrededor del 80%-90% de confluencia (Figura 2A) (alrededor de 7,5 ± 4,5 días), se realizó la tripsinización de las células adherentes (Tabla 2 y Figura 2B).
El rendimiento celular antes del paso 1 varió ampliamente incluso cuando se observó la misma confluencia antes de la tripsinización (Tabla 2). Esto puede explicarse por el hecho de que las células pueden haber crecido en capas. También se evaluaron diferentes parámetros del ADSC de los pacientes en diferentes períodos, como se demuestra en la Tabla 2.
Algunas muestras (Caso 1, Caso 2, Caso 7) no pudieron ser evaluadas con respecto al porcentaje de ADSC confirmado y el número estimado de ADSC en cultivo debido a la contaminación bacteriana y la falta de células disponibles para realizar inmunofenotipado de SVF criopreservado. De acuerdo con la Calculadora Rho 33 de Spearman, no se encontraron diferencias estadísticas entre el rendimiento celular SVF y los días a P1 (r = 0.37816, p = 0.31561), entre el rendimiento celular SVF antes y después de ir a P1 (r = -0.33333, p = 0.38071), y entre los días hasta P1 y el rendimiento celular antes de ir a P1 (r = -0.53783, p = 0,13529). Además, no se observaron diferencias significativas al correlacionar el rendimiento celular SVF con el porcentaje promedio de ADSC confirmado (r = -0,02857, p = 0,95716) y entre el porcentaje promedio de ADSC confirmado y el rendimiento celular antes de pasar a P1 (r = 0,42857, p = 0,3965). Además, la correlación entre el IMC y el rendimiento celular SVF no pudo considerarse estadísticamente significativa (r = -0,46667, p = 0,20539). La Tabla 3 muestra los datos citométricos de flujo realizados en células SVF criopreservadas. Las células SVF iniciales contenían un subconjunto de células positivas para marcadores hematopoyéticos (CD45, CD11b, CD19, HLA-DR)34. A partir de la población inicial de células SVF, un subgrupo particular expresó marcadores asociados a células estromales CD11b 34 y CD1934. Los niveles de CD73 34, CD90 34 y CD10534 fueron intermedios entre estos valores. El SVF inicial contenía una subpoblación de células positivas para marcadores asociados a células madre (Figura 3). Una media del 79% de las FVS expresó el marcador asociado a HSC CD3434.
En total, fueron necesarios 21 min para los tres lavados, 30 min para la digestión de la colagenasa, 10 min para la centrifugación y 5 min para el recuento de células y el recubrimiento.
Figura 1: Pasos del protocolo de aislamiento de células madre derivadas de tejido adiposo . (A) Bolsa para el transporte de lipoaspirados en un sistema cerrado. (B) El paso de la bolsa de descanso se repite tres veces, después del lavado. (C) Lipoaspirar después de tres lavados con DPBS. (D) Lipoaspirado después de la digestión de la colagenasa. (E) El lipoaspirado después de la digestión se distribuye en un tubo de 50 ml. (F) Lipoaspirado digerido después de la centrifugación. (G) Aislamiento final del proceso con el pellet con la fracción vascular estromal (SVF). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfología y viabilidad de las ADSC . (A) Células madre derivadas de tejido adiposo mesenquimal adherente plástico en el primer paso después del aislamiento en microscopía óptica. Las células muestran adhesión a la morfología plástica y similar a los fibroblastos. (B) Ensayo de azul de tripano que muestra células viables contadas en la cámara de Neubauer utilizando un microscopio óptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Subpoblación de células positivas para marcadores asociados a células madre en SVF del caso 9 después de 8 meses de criopreservación. R1: Región celular total analizada en FSC (Forward Scatter) x SSC (Side Scatter) (Tamaño x Complejidad); R2: región CD45 negativa, cuyas poblaciones CD73, CD90 y CD105 son positivas en esta región. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ensayo de diferenciación . (A) Diferenciación ADSC en condrocitos. (B) Diferenciación ADSC en osteocitos. (C) Diferenciación ADSC en adipocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Paciente | Edad en el momento de la recogida (años) | Peso (kg) | Altura (metro) | IMC* |
| Caso 1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| Caso 2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| Caso 3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| Caso 4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| Caso 5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| Caso 6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| Caso 7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| Caso 8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| Caso 9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
Tabla 1: Datos de las muestras de los individuos estudiados. *IMC: índice de masa corporal.
| Paciente | Volumen recogido (mL) | SVF Rendimiento celular (célula/ml) (x 105) | Volumen en cultivo (ml) | Porcentaje promedio de ADSC confirmados (%) | Número de células en cultivo inicial (x 105) | Número estimado de ADSC en cultivo (x 105) | Días hasta P1 | Rendimiento celular antes de pasar a P1 (x 105) |
| Caso 1 | 96 | 9.2 | 2 | Na | 18.4 | Na | 10 | 18 |
| Caso 2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| Caso 3 | 100 | 26.2 | 1 | Na | 26.2 | Na | 12 | 6.6 |
| Caso 4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| Caso 5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| Caso 6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| Caso 7 | 98 | 6.8 | 2 | Na | 13.6 | Na | 8 | 10.5 |
| Caso 8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| Caso 9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| SD | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
Tabla 2: Datos de diferentes etapas del procedimiento de los nueve pacientes analizados. SVF: fracción vascular estromal; ADSC: células madre derivadas de tejido adiposo; P1: pasaje 1; NA: datos no disponibles.
| MUESTRA | % de ADSC DETERMINADO POR ANTICUERPOS MONOCLONALES | % DE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS DETERMINADAS POR ANTICUERPOS MONOCLONALES | ENSAYO DE VIABILIDAD CELULAR Y TIEMPO DE CRIOPRESERVACIÓN DE SVF | |||||||||
| CD45-(*) | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | Significar | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b+ | CD19+ | VIVO/MUERTO + | |||
| Caso 2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39.54% (2 años) | ||
| Caso 4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38.30% (2 años) | ||
| Caso 5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23.06% (2 años) | ||
| Caso 6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56.76% (2 años) | ||
| Caso 8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55,56% (1 año) | ||
| Caso 9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72.34% (8 meses) | ||
Tabla 3: Datos de citometría de flujo de seis de los pacientes. (*) A partir de estas células CD45-, se determinó el % de ADSC con diferentes combinaciones de marcadores de células madre. ADSC: células madre derivadas de tejido adiposo; SVF: fracción vascular estromal; (*) A partir de estas células CD45-, se determinó el % de ADSC con diferentes combinaciones de marcadores de células madre.
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Discussion
Rendimiento de aislamiento
Está bien establecido que el proceso de criopreservación, frecuentemente requerido en la terapia celular, resulta en una pérdida celular significativa, a veces superior al 50%29,30,35. Por lo tanto, una mejora técnica para obtener un alto rendimiento celular inicial en aislamiento es fundamental. El método de recolección de lipoaspirado y el método de aislamiento de las células deben centrarse en preservar un mayor número de células, mantener una alta viabilidad y extraer el máximo número de células del material inicial, teniendo en cuenta el cultivo y la manipulación a largo plazo de las células. Por lo tanto, se requiere el mantenimiento del cultivo directo para mantener las células alejadas de la apoptosis, la senescencia o la inestabilidad genética, ya que es probable que la terapia celular sea efectiva y segura para los pacientes.
Hasta donde sabemos, no hay ningún artículo previo que utilice este conjunto de pasos para el aislamiento de células madre mesenquimales derivadas de lipoaspirado, lo que resulta en una técnica de ahorro de tiempo y costo-beneficio. En este estudio, cada paso metodológico fue razonado de acuerdo con la literatura que mostró el mayor rendimiento celular final en el aislamiento celular. La novedad de la técnica realizada en este estudio fue el uso de la aspiración manual asociada a una serie de lavados de lipoaspirado, con el posterior reposo de la bolsa. La bolsa de recolección utilizada para transportar y procesar el lipoaspirado permitió que los fragmentos de tejido no digeridos no participaran en la digestión de la colagenasa. El paso más crítico es agregar cloruro de calcio a la solución de digestión fresca, ya que potencia la acción de la colagenasa. La ganancia de tiempo aún no se informa en la literatura con un método de descongelación celular que permite células viables incluso después de un largo tiempo de criopreservación. El rendimiento celular SVF encontrado en este estudio varió ampliamente de 6.15 a 26.2 x 10 5 células/ml con un promedio de 15.7 x 105 células/ml. Esto puede deberse a la presencia de una cantidad más significativa de solución de adrenalina succionada, que puede haber sido mayor o menor según la etapa del procedimiento quirúrgico y el número de otros tipos de células conocidas que generalmente se encuentran en la FVS. Aunque algunos estudios han encontrado correlaciones negativas entre el IMC y el rendimiento de ADSC 36,37, este estudio no encontró correlación significativa, como los otros dos estudios38,39, disminuyendo la posibilidad de que esa sea la causa de la increíble variedad de rendimiento celular SVF encontrado en este estudio. Estos datos muestran que el menor rendimiento celular SVF obtenido fue de 6,15 x 105 células/mL. Algunos estudios ya habían medido la eficiencia del aislamiento de ADSC según la técnica quirúrgica para la obtención de lipoaspirado. Un estudio obtuvo 0,087 x 105 células/ml en FVS recién aislada para la técnica de liposucción con solución de adrenalina (como se usó en este estudio) y 0,143 x 105 células/ml sin ella26. Este trabajo destacó la importancia de la inyección de solución de adrenalina debido al efecto vasoconstrictor que disminuye el sangrado intraoperatorio y los hematomas, como la mayoría de los cirujanos eligen realizar en la práctica clínica. Otro estudio demostró que las ADSC vivas aisladas variaron de 0 a 0,59 x 10 5 células/g de lipoaspirado cosechado, con un promedio de 0,295 (±0,25) x 105 células/g de tejido31. Algunos estudios han probado diferentes formas de lograr un mayor rendimiento de ADSC. Uno de estos estudios logró cerca de 350 x 105 para el método que presentó diversos constituyentes en el tampón de digestión de colagenasa y el uso de un agitador orbital40. Otro estudio mostró 29,7 (±0,2) x 105 células/ml como el número total de células SVF del área abdominal41. El área abdominal elegida en este estudio sigue siendo el área de referencia para la mejor disponibilidad y accesibilidad del lipoaspirado42. La región corporal para la recolección de lipoaspirados, entre otros factores como la edad del donante y el método de recolección elegido, es un fuerte determinante de la calidad de los rendimientos de ADSC.
La posibilidad de que la contaminación de microorganismos causara la falta de disponibilidad de células para continuar los experimentos fue el único problema de ejecución que limitó la finalización de este estudio. Incluso utilizando antibióticos y requisitos de Buenas Prácticas de Fabricación, la contaminación puede ocurrir debido a la falta de un ambiente aséptico total para realizar la aspiración de grasa.
Inmunofenotipado de FVS
Según el Comité de Células Madre Mesenquimales y Tisulares de la Sociedad Internacional de Terapia Celular 34, uno de los tres criterios mínimos para definir las células madre mesenquimales humanas es que las células deben expresar CD105 34, CD73 34 y CD90 34 y no deben expresar CD45 34, CD34 34, CD14 34 o CD11b 34, CD79a 34 o CD19 34, y moléculas de membrana superficial HLA-DR34. Mitchell43 probó células SVF frescas mediante inmunofenotipado y encontró un máximo del 54% de células con marcadores de superficie ADSC. En este estudio, el inmunofenotipado reveló un mayor porcentaje de ADSC (células no hematopoyéticas) confirmadas de hasta el 78,91% en la FVS después de la criopreservación a largo plazo (que oscila entre el 37,95% y el 78,91% con una media del 53,68%). La evidencia muestra que los progenitores de una población de células madre aún no comprometidas no expresan el marcador CD3434,44,45. Dependiendo de la etapa de diferenciación, las células madre CD3434 negativas pueden generar no solo progenitores hematopoyéticos sino también precursores mesenquimales más específicos, como osteoclastos, condrocitos, miocitos, adipocitos y otros. Algunos estudios demostraron la sorprendente plasticidad de la población primitiva de células madre, compuesta por células con función de células estromales y progenitores hematopoyéticos y mesenquimales45. De acuerdo con la literatura, el papel funcional completo de CD3434 en la formación de tejido en células SVF es aún desconocido46. Mitchell43 mostró una media de 60% de células de SVF que expresan el marcador CD3434, mientras que, en este estudio, la media fue de 78,81%. Se sabe que la expresión del marcador de superficie CD3434 disminuye a lo largo de los pasajes.
Células adherentes y ensayo de diferenciación
Dependiendo del número de células obtenidas después del aislamiento, el número de células sembradas en el primer cultivo varió. El primer tiempo de cultivo para alcanzar una confluencia del 80%-90% en matraces de 75 cm2 tomó un promedio de 8,4 días y una desviación estándar de 7,5 (±4,5) días que varió de 6,6 a 16,1 x 105 células/ml. Cabe señalar que incluso para los casos con menor rendimiento celular, el primer tiempo de cultivo condujo a altos índices de rendimiento celular en comparación con la literatura, probablemente debido a la mejor disponibilidad de células viables mantenidas durante todo el proceso de recolección y aislamiento. Un estudio obtuvo un rendimiento celular de 3,75 (±1,42) x 105 ADSC por ml de lipoaspirado dentro de un período de cultivo de 4,1 (±0,7) días47. Otro estudio demostró un rendimiento de células SVF nucleadas de 3,08 (±1,40) x 105 por milímetro con una media de 6,0 (±2,4) días en el primer período de cultivo43. En este estudio, al estimar el número de ADSC sembradas en cultivo, que varió en función del número de células observadas en el SVF a partir de la recolección del mismo volumen de 100 mL de lipoasaspirado, se verificó que el número de días para alcanzar P1 no tenía relación con el volumen celular. Por ejemplo, para el caso 9, en el que se incubaron 12,2 x 105 células, se requirieron 6 días para alcanzar la confluencia del 80%-90%. Para el Caso 6, en el que se sembraron 14,6 x 105 células en cultivo, fue necesario un período más prolongado (10 días) para alcanzar el mismo nivel de confluencia. Tal vez, un número mínimo de ADSC es suficiente para el primer período de adhesión. Puede haber una variación interindividual significativa, como comorbilidades, edad y estado general de salud. Algunos estudios en la literatura cuestionaron la importancia de considerar la variabilidad interindividual de los pacientes para el rendimiento de células SVF48,49.
Según el Comité de Células Madre Mesenquimales y Tisulares de la Sociedad Internacional de Terapia Celular34, las células mesenquimales deben tener la capacidad de diferenciarse en tres tipos de células diferentes como linajes osteogénicos, adipogénicos y condrogénicos, como se demostró en la Figura 4.
Viabilidad celular, criopreservación e inestabilidad genética
Se han utilizado diferentes métodos para determinar la pérdida de viabilidad, definida como daño a la integridad de la membrana plasmática50. Sin embargo, los cultivos también pueden presentar células apoptóticas tempranas que estos enfoques pueden ignorar porque mantienen una membrana plasmática intacta, pero no son viables. Los resultados aquí reportados muestran un gran rango en el marcador de viabilidad, de 23.06% -72.34%, con una media de 47.6% después de la criopreservación a largo plazo. Teniendo en cuenta que la criopreservación es un paso significativo en relación con la terapia celular, la recuperación del número máximo de células madre viables y funcionales después de la descongelación es uno de los temas prioritarios para el éxito de la terapia celular. La literatura ha demostrado que al menos el 50% de la viabilidad celular se pierde de 1 a 4 meses después de la criopreservación43. En particular, los índices más bajos presentados en este estudio son del Caso 5, Caso 4 y Caso 2, que son las muestras criopreservadas más antiguas (aproximadamente 2 años). Aunque presentaron los índices de viabilidad más bajos, demostraron un alto rendimiento celular en el ensayo de exclusión de colorante azul de tripano en SVF fresca. Aunque la literatura apoya las causas de la pérdida de viabilidad, estas tasas son más bajas de lo esperado. Las fluctuaciones de temperatura en el almacenamiento celular por razones técnicas pueden causar el aumento y acumulación de estrés y favorecer la acumulación de porciones acuosas, generando cristales que dañan la membrana plasmática durante la criopreservación a largo plazo51. La literatura muestra más del 70% de viabilidad para muestras con el mismo o mayor tiempo de congelación. Sin embargo, el control de viabilidad se realizó con una técnica diferente a la realizada en este estudio52. Otro estudio mostró que la criopreservación más prolongada afecta negativamente la viabilidad celular31, lo que puede explicarse por las variaciones de temperatura en el congelador de -80 °C. Por lo tanto, las células a menudo necesitan permanecer demasiado tiempo en cultivo, lo que aumenta el estrés del ciclo celular, lo que conlleva riesgos de inestabilidad genética y, en consecuencia, compromete la terapia celular. También existe un consenso en la literatura que indica algunos factores de estrés y cómo afectan la estabilidad citogenética celular, lo cual es esencial para mantener el cultivo prolongado de células madre requerido para la terapia celular35,53.
Beneficio de la metodología
Hasta la fecha, la literatura no muestra un protocolo estandarizado para aislar ADSC con el objetivo de aplicaciones clínicas. La mayoría de los estudios demuestran protocolos complejos y lentos24. En este estudio, se debe enfatizar la eficiencia del método versus el tiempo exigido para completar el rendimiento celular inicial: aproximadamente 1,5 h. Según la literatura, el aislamiento de las células madre derivadas de tejido adiposo puede tomar alrededor de 3 h a 8 h54,55. Por lo tanto, la ganancia de tiempo aliada a los altos ingresos celulares es fundamental para el avance terapéutico de la medicina regenerativa. Se deben realizar más evaluaciones de viabilidad celular paralelas a las realizadas en este trabajo para mejorar este método. Se necesitan ensayos controlados aleatorios adicionales que incorporen una muestra más extensa utilizando esta metodología para refrendar estos resultados.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Agradecemos a los pacientes que se ofrecieron como voluntarios para participar y al personal médico y de enfermería del Hospital São Paulo. Este estudio fue apoyado por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) y el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
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