Summary
يصف البروتوكول الحالي منهجية محسنة لعزل ADSC مما يؤدي إلى عائد خلوي هائل مع زيادة الوقت مقارنة بالأدبيات. توفر هذه الدراسة أيضا طريقة مباشرة للحصول على عدد كبير نسبيا من الخلايا القابلة للحياة بعد الحفظ بالتبريد على المدى الطويل.
Abstract
أصبحت الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المشتقة من الأنسجة الدهنية جذابة بشكل متزايد لأنها تظهر ميزات مناسبة وهي مصدر يمكن الوصول إليه للتطبيقات السريرية التجديدية. تم استخدام بروتوكولات مختلفة للحصول على الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. توضح هذه المقالة الخطوات المختلفة لبروتوكول توفير الوقت المحسن للحصول على كمية أكثر أهمية من ADSC، مما يوضح كيفية حفظ ADSC وإذابته بالتبريد للحصول على خلايا قابلة للحياة لتوسيع الثقافة. تم جمع مائة ملليلتر من شفط الدهون باستخدام شفط الدهون بحقنة من عيار 26 سم وثلاث ثقوب وعيار 3 مم ، من منطقة البطن لتسعة مرضى خضعوا لاحقا لعملية شد البطن الاختيارية. تم عزل الخلايا الجذعية بسلسلة من الغسلات باستخدام محلول ملحي مخزن للفوسفات (DPBS) من Dulbecco مع الكالسيوم واستخدام الكولاجيناز. تم حفظ خلايا الكسر الوعائي اللحمي (SVF) بالتبريد ، وتم فحص صلاحيتها عن طريق التنميط المناعي. كان العائد الخلوي SVF 15.7 × 105 خلايا / مل ، يتراوح بين 6.1-26.2 خلية / مل. وصلت خلايا SVF الملتصقة إلى التقاء بعد متوسط 7.5 (±4.5) يوما ، بمتوسط عائد خلوي يبلغ 12.3 (± 5.7) × 105 خلايا / مل. تراوحت صلاحية SVF المذاب بعد 8 أشهر و 1 سنة و 2 سنة بين 23.06٪ -72.34٪ بمتوسط 47.7٪ (±24.64) مع أدنى جدوى مرتبطة بحالات التجميد لمدة عامين. أدى استخدام محلول DPBS المكمل بالكالسيوم وأوقات استراحة الكيس لترسيب الدهون مع وقت أقصر من هضم الكولاجيناز إلى زيادة العائد الخلوي النهائي للخلايا الجذعية. كان الإجراء التفصيلي للحصول على غلات عالية من الخلايا الجذعية القابلة للحياة أكثر كفاءة فيما يتعلق بالوقت والعائد الخلوي من التقنيات من الدراسات السابقة. حتى بعد فترة طويلة من الحفظ بالتبريد ، تم العثور على خلايا ADSC قابلة للحياة في SVF.
Introduction
الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية مفيدة في كل من البحوث الأساسية والتطبيقية. يتجاوز استخدام هذا النوع من الخلايا البالغة القضايا الأخلاقية - مقارنة باستخدام الخلايا الجنينية أو غيرها - كونه أحد أكثر مجالات الدراسة الواعدة في هندسة تجديد الأنسجة الذاتية والعلاج الخلوي1 ، مثل منطقة الأورام ، وعلاج الأمراض التنكسية ، والتطبيقات العلاجية في منطقة الجراحة الترميمية2،3،4 ، 5. تم الإبلاغ سابقا عن وجود مصدر وفير للخلايا الجذعية متعددة القدرات ومتعددة القدرات في جزء الخلايا الوعائية اللحمية من الأنسجة الدهنية 6,7. تعتبر هذه ADSC مرشحة رائعة للاستخدام في العلاج بالخلايا والزرع / التسريب حيث يمكن الحصول بسهولة على عدد كبير من الخلايا ذات القدرة القوية على التوسع خارج الجسم الحي بعائد مرتفع من إجراء طفيف التوغل 5,8.
كما ثبت أن الأنسجة الدهنية تقدم قدرة أكبر على توفير الخلايا الجذعية الوسيطة من مصدرين آخرين (نخاع العظام وأنسجة الحبل السري)9. إلى جانب كونه ضعيف المناعة ولديه قدرة عالية على الاندماج في الأنسجة المضيفة والتفاعل مع الأنسجة المحيطة4،10 ، يتمتع ADSC بقدرة متعددة القدرات على التمايز في خطوط الخلايا ، مع تقارير عن تمايز غضروفي ، عظمي ، وعضلي المنشأ في ظل ظروف الثقافة المناسبة11،12،13 ، وفي الخلايا ، مثل البنكرياس ، خلايا الكبد ، والخلايا العصبية14،15،16.
يتفق المجتمع العلمي على أن التأثير المناعي للخلايا الجذعية الوسيطة هو آلية عمل أكثر صلة بالعلاج الخلوي17،18،19 من خاصية تمايزها. واحدة من أهم مزايا استخدام ADSC هي إمكانية التسريب الذاتي أو التطعيم ، لتصبح علاجا بديلا للعديد من الأمراض. بالنسبة للطب التجديدي ، تم استخدام ADSC بالفعل في حالات تلف الكبد ، وإعادة بناء عضلة القلب ، وتجديد الأنسجة العصبية ، وتحسين وظيفة العضلات الهيكلية ، وتجديد العظام ، وعلاج السرطان ، وعلاج مرض السكري20,21.
وحتى هذا التاريخ، هناك 263 تجربة سريرية مسجلة لتقييم إمكانات مركز أبوظبي للأبحاث، مدرجة على الموقع الإلكتروني للمعاهد الوطنية الأمريكية للصحة22. تم وضع بروتوكولات مختلفة لحصاد الأنسجة الدهنية ، ولكن لا يوجد إجماع في الأدبيات حول طريقة موحدة لعزل ADSC للاستخدام السريري23،24. يمكن أن تؤثر طرق معالجة Lipoaspirate أثناء الجراحة وبعدها بشكل مباشر على صلاحية الخلية ، والعائد الخلوي النهائي25 ، وجودة مجموعة ADSC20. فيما يتعلق بالمعالجة الجراحية المسبقة ، ليس من الثابت جيدا أي تقنية جراحية مسبقة المعالجة تنتج عددا أكبر من الخلايا القابلة للحياة بعد العزل أو ما إذا كان محلول التخدير المحقون في الأنسجة الدهنية يؤثر على إنتاجية الخلية ووظائفها26. وبالمثل ، يمكن أن يؤدي الفرق بين تقنيات الحصول على الخلايا الدهنية إلى انخفاض بنسبة 70٪ في عدد ADSC20 القابل للحياة. وفقا للأدبيات ، يجب تجنب العلاجات الميكانيكية للحصول على مجموعات الخلايا ذات القدرة العالية - بما في ذلك الموجات فوق الصوتية - لأنها يمكن أن تكسر الأنسجة الدهنية20. ومع ذلك ، فإن طريقة شفط الدهون اليدوية باستخدام المحاقن أقل ضررا ، مما يتسبب في تدمير أقل للخلايا ، حيث ينتج عن شفط الدهون المنتفخ عدد كبير من الخلايا بأفضل جودة26.
تستخدم هذه التقنية محلول ملحي مع يدوكائين وإبينفرين يتم حقنه في منطقة شفط الدهون. لكل 3 مل من حجم المحلول المحقون ، يتم استنشاق 1 مل. في هذه الدراسة ، تم إجراء تقنية شفط الدهون الرطب ، حيث يتم شفط 0.2 مل من الأنسجة الدهنية لكل 1 مل من الأدرينالين والمحلول الملحي المحقون. يعد استخدام الإنزيمات الهاضمة ، وخاصة الكولاجيناز ، أمرا شائعا في عملية عزل ADSC.
بعد خطوة العزل الأولى في المختبر ، تسمى الحبيبات النهائية الكسر الوعائي اللحمي (SVF). يحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا27 ، بما في ذلك خلايا السلائف البطانية ، والخلايا البطانية ، والبلاعم ، وخلايا العضلات الملساء ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا المحيطة ، والخلايا الشحمية المسبقة ، و ADSCs ، القادرة على الالتصاق. بمجرد الانتهاء من العزل النهائي من الثقافات في المختبر ، يتم التخلص من الخلايا التي لم تلتصق بالبلاستيك في التبادلات المتوسطة. بعد ثمانية أسابيع من التوسع والتغيرات المتوسطة والممرات، تمثل ADSCs معظم عدد الخلايا في القوارير20. واحدة من أهم مزايا استخدام الخلايا الجذعية المعزولة المشتقة من الدهون لعلاج مستقبلي محتمل هي إمكانية الحفظ بالتبريد. وقد ثبت أن شفاطات الدهون المحفوظة بالتبريد هي مصدر محتمل لخلايا SVF حتى بعد 6 أسابيع من التجميد28 ، مع النشاط البيولوجي حتى بعد عامين من الحفظ بالتبريد29 ، والقدرة الكاملة على النمو والتمايز في الثقافة30. ومع ذلك ، أثناء عملية الذوبان ، عادة ما يتم فقدان نسبة كبيرة من الخلايا31. لذلك ، يجب أن تضمن عملية إزالة شفط الدهون والطرق التالية لعزل الخلايا أعلى إنتاجية للخلايا.
تصف هذه الدراسة منهجية أسرع لجمع وعزل كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي، مما يدل على ارتفاع الإنتاجية الخلوية والجدوى لتحسين كفاءة العلاجات الخلوية. علاوة على ذلك ، تم تقييم تأثير هذه التقنية المحسنة بعد الحفظ بالتبريد SVF على المدى الطويل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة ل UNIFESP (رقم البروتوكول: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505) ، والتي أجريت بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى وفقا لإعلان هلسنكي (2004). تتكون عينة الدراسة الحالية من تسع مريضات ، تتراوح أعمارهن بين 33-50 عاما (متوسط العمر 41.5) ومتوسط مؤشر كتلة الجسم الأولي (BMI) 24.54 (يتراوح بين 22.32-26.77) (الجدول 1) الذين خضعوا لعملية شد البطن التجميلية بسبب زيادة الجلد بعد الحمل ، في قسم الجراحة التجميلية بجامعة ساو باولو الفيدرالية (UNIFESP) ، البرازيل. للحد من التحيز ، تم اختيار المرضى كمجموعة متجانسة مع مراعاة الجنس والعمر ومؤشر كتلة الجسم. مجموعات البيانات المستخدمة و / أو التي تم تحليلها خلال هذه الدراسة متاحة من المؤلف المقابل بناء على طلب معقول.
1. مجموعة من ليبواسبيرات
ملاحظة: يجب إجراء هذه الخطوة في مركز الجراحة.
- استخدم 4٪ غلوكونات الكلورهيكسيدين (انظر جدول المواد) لإعداد الجلد والتعقيم.
- إجراء شق الجلد تحت الجلد 2 مم (بين الأدمة الفرعية و aponeurosis). أدخل قنية كلاين من عيار 26 مم 3 جم ثلاثي الثقوب و 3 مم ومحقنة لحقن حجم إجمالي قدره 500 مل من محلول الأدرينالين (1 مجم / مل) (انظر جدول المواد) المخفف في محلول ملحي (1: 1,000,000) في منطقة البنية التحتية.
- قم بتوصيل حقنة سعة 60 مل بقنية شفط الدهون من عيار 26 مم 3 جم ثلاثية الثقوب وعيار 3 مم وأدخلها من خلال شق الجلد ، وقفل المكبس لإنشاء فراغ.
- قم بحركات الدفع والسحب بحيث ، مع الفراغ الناتج ، تبقى الشفطية الشحمية في حقنة 60 مل.
- باستخدام موصل معقم مع صمام ، انقل 100 مل من شفاط الدهون المجمعة إلى كيس نقل كلوريد البولي فينيل سعة 150 مل (انظر جدول المواد).
- قم بتعبئة كيس النقل في صندوق بوليسترين في درجة حرارة الغرفة (~ 25 درجة مئوية) وخذه على الفور إلى المختبر. لا تستغرق أكثر من 30 دقيقة لبدء معالجة الأنسجة.
2. معالجة ليبواسبات
ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في المختبر.
- أولا ، قم بوزن الكيس ، وقياس درجة الحرارة باستخدام مقياس حرارة سريري رقمي غير متصل بالأشعة تحت الحمراء ، واترك الكيس يستريح لمدة 5 دقائق داخل غرفة التدفق الصفحي لترسيب الطبقات الدهنية (الفقاعات) وفصل الأنسجة التي تحتوي على الخلايا ذات الاهتمام.
- أداء سلسلة من يغسل الأنسجة. الغسيل الأول: حقن 100 مل من DPBS بالكالسيوم (1x) في كيس النقل واخلطه باليدين.
- اتركه لمدة 5 دقائق وقم بإزالة معظم السائل القاعدي الذي يترسب.
- تخلص من السائل القاعدي باستخدام حقنة سعة 60 مل متصلة بمحول الكيس. يجب تكرار هذه العملية مرتين.
- أضف 100 مل من محلول الهضم إلى الكيس (93 مل من DPBS الخالي من الكالسيوم + 60 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم (1 جم / لتر) + 7 مل من كولاجيناز معقم 0.075٪ ، انظر جدول المواد) واتركه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت التحريك البطيء.
- انقل كل محتوى الكيس إلى أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 مل وقم بطردها بالطرد المركزي عند 400 × جم عند 22 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها وأضف 5 مل من محلول الجلوكوز المنخفض المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بنسبة 20٪ FBS (مصل بقري الجنين) إلى حبيبات الخلية (الشكل 1).
3. عد خلايا SVF
- امزج محلولا جديدا من 10 ميكرولتر من التربان الأزرق بنسبة 0.05٪ في الماء المقطر مع 10 ميكرولتر من التعليق الخلوي لمدة 5 دقائق.
- عد الخلايا القابلة للحياة في غرفة عد خلايا نيوباور32 باستخدام مجهر ضوئي مقلوب (انظر جدول المواد) بتكبير 20x.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط واقي من البرودة (5 مل من FBS + 10٪ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد - DMSO) بتركيز 1 × 106 خلايا / مل.
- ضع 1 مل من هذا المزيج في كريوفيال. استخدم حاوية تجميد (انظر جدول المواد) بمعدل تبريد (1 درجة مئوية / دقيقة إلى -80 درجة مئوية).
- يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة 1 سنة.
- بعد هذا الوقت ، قم بتخزينه في صناديق كاسيت قياسية مغمورة في مرحلة بخار النيتروجين السائل (-165 درجة مئوية).
4. عملية ذوبان الخلايا
- أخرج القوارير من النيتروجين السائل وضعها على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- ضع خلايا SVF في أنبوب مخروطي مع 4 مل من DMEM (نسبة منخفضة من الجلوكوز المكمل بنسبة 20٪ FBS) مسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية.
- جهاز طرد مركزي عند 400 × جم عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة المادة الطافية وأضف 1 مل من DMEM (الجلوكوز المنخفض) + 10٪ FBS. إجراء التنميط المناعي باتباع الخطوات أدناه.
5. تقنية قياس التدفق الخلوي (وضع العلامات المتعددة للنمط المناعي)
- ضع 1 مل من حبيبات الخلية (تركيز 1000 خلية / ميكرولتر) في خمسة أنابيب قياس خلوي (200 ميكرولتر لكل منها).
- جهاز طرد مركزي عند 400 × جم عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
- أضف 300 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (10x) ، وأجهزة طرد مركزي عند 400 × جم عند 22 درجة مئوية وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
- تحضير خمسة أنابيب لمجموعات علامات مختلفة على النحو التالي: 5 ميكرولتر من CD11B / 5 ميكرولتر من CD19 / 20 ميكرولتر من CD45 ؛ 5 ميكرولتر من CD73/20 ميكرولتر من CD90/5 ميكرولتر من CD105/20 ميكرولتر من CD45؛ 20 ميكرولتر من CD34/5 ميكرولتر من HLA-DR/20 ميكرولتر من CD45؛ فحص صلاحية الخلية -5 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت التفاعلية. (انظر جدول المواد) وأنبوب به خلايا غير ملوثة و PBS كعنصر تحكم سلبي. تجانس في دوامة واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
- جهاز طرد مركزي عند 400 × جم عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأضف 500 ميكرولتر من PBS (10x) ، وتابع فرز الخلايا.
ملاحظة: يتم الحصول على خمسة آلاف حدث لكل جسم مضاد تم تعيينه في مقياس التدفق الخلوي المكون من أربعة ألوان وخمسة معلمات ويتم تحليلها باستخدام برنامج CellQuest.
- جهاز طرد مركزي عند 400 × جم عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأضف 500 ميكرولتر من PBS (10x) ، وتابع فرز الخلايا.
6. بذر الممر 1 (P1)
- البذور 2 × 105 خلايا في قارورة ثقافة 75 سم2 .
- أضف 12 مل من DMEM منخفض الجلوكوز + 20٪ من FBS + 10٪ مضاد حيوي / مضاد حيوي (مع 10000 وحدة بنسلين ، 10 مجم ستربتومايسين ، و 25 ميكروغرام أمفوتريسين B لكل مل ، 0.1 ميكرومتر).
- عندما تصل الخلايا إلى ما بين 80٪ -90٪ ، قم بإجراء التربسين للخلايا الملتصقة باستخدام 2 مل من 0.25٪ EDTA-trypsin لمدة 3 دقائق.
- عد الخلايا مرة أخرى (كما هو مذكور في الخطوة 3).
- إجراء التنميط المناعي مرة أخرى (كما هو مذكور في الخطوة 5).
7. التحليل الإحصائي
- استخدم حاسبة رو33 من سبيرمان لقياس قوة الارتباط بين المتغيرات التالية مع P < 0.05 ، كما هو مذكور أدناه.
- حدد العائد الخلوي SVF وعدد الأيام التي يبقى فيها SVF في الثقافة في المقطع الأول (P1) حتى التقاء 80٪ -90٪ (أيام إلى P1).
- حدد العائد الخلوي SVF قبل وبعد الانتقال إلى P1.
- ضع في اعتبارك الأيام إلى P1 والعائد الخلوي قبل الذهاب إلى P1.
- حدد العائد الخلوي SVF مع متوسط النسبة المئوية ل ADSC المؤكد.
- احسب النسبة المئوية ل ADSC المؤكد والعائد الخلوي قبل الانتقال إلى P1.
- تحديد العائد الخلوي لمؤشر كتلة الجسم و SVF.
8. مقايسة التمايز
- قم بإجراء اختبار التمايز باتباع بروتوكول مجموعة التمايز (انظر جدول المواد). يوضح الشكل 4 نتائج الحالة 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الجدول 1 توصيف الأفراد التسعة الذين تمت دراستهم ، بما في ذلك العمر والوزن والطول ومؤشر كتلة الجسم.
وفقا للعائد الخلوي المقدم في البداية ، تم حساب حجم الخلية الملقحة في الثقافة ليكون أقرب ما يمكن إلى سعة دورق الثقافة 75 سم2 . ويرد في الجدول 2 وصف لحجم العينة المصنفة في كل حالة. بعد ذلك ، وفقا للعائد الخلوي الأولي ، تم تحديد حجم متغير من الخلايا لكل عينة: 1 مل للعينات ذات العائد الخلوي الأعلى ، و 1.1 مل للعينات ذات العائد الخلوي المتوسط ، و 2 مل للعينات ذات العائد الخلوي المنخفض وذلك لأداء المزيد من البذر الخلوي المماثل بين الحالات. عندما وصلت الثقافة إلى حوالي 80٪ -90٪ التقاء (الشكل 2 أ) (حوالي 7.5 ± 4.5 أيام) ، تم إجراء التربسين للخلايا الملتصقة (الجدول 2 والشكل 2 ب).
اختلف العائد الخلوي قبل المرور 1 على نطاق واسع حتى عندما لوحظ نفس الالتقاء قبل التربسين (الجدول 2). يمكن تفسير ذلك من خلال حقيقة أن الخلايا قد نمت في طبقات. كما تم تقييم معلمات مختلفة من ADSC للمرضى في فترات مختلفة ، كما هو موضح في الجدول 2.
تعذر تقييم بعض العينات (الحالة 1 والحالة 2 والحالة 7) فيما يتعلق بالنسبة المئوية ل ADSC المؤكد والعدد التقديري ل ADSC في المزرعة بسبب التلوث البكتيري ونقص الخلايا المتاحة لأداء التنميط المناعي SVF المحفوظ بالتبريد. وفقا لحاسبة سبيرمان رو 33 ، لم يتم العثور على فروق إحصائية بين العائد الخلوي SVF والأيام إلى P1 (r = 0.37816 ، p = 0.31561) ، بين العائد الخلوي SVF قبل وبعد الانتقال إلى P1 (r = -0.33333 ، p = 0.38071) ، وبين الأيام إلى P1 والعائد الخلوي قبل الانتقال إلى P1 (r = -0.53783 ، p = 0.13529). علاوة على ذلك، لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية عند ربط العائد الخلوي SVF بمتوسط النسبة المئوية ل ADSC المؤكد (r = -0.02857، p = 0.95716) وبين متوسط النسبة المئوية ل ADSC المؤكد والعائد الخلوي قبل الانتقال إلى P1 (r = 0.42857، p = 0.3965). أيضا ، لا يمكن اعتبار العلاقة بين مؤشر كتلة الجسم والعائد الخلوي SVF ذات دلالة إحصائية (r = -0.46667 ، p = 0.20539). يوضح الجدول 3 بيانات قياس التدفق الخلوي التي تم إجراؤها على خلايا SVF المحفوظة بالتبريد. احتوت خلايا SVF الأولية على مجموعة فرعية من الخلايا الإيجابية لعلامات المكونة للدم (CD45 ، CD11b ، CD19 ، HLA-DR)34. من مجموعة خلايا SVF الأولية ، عبرت مجموعة فرعية معينة عن علامات CD11b 34 و CD1934 المرتبطة بالخلايا اللحمية. كانت مستويات CD73 34 و CD90 34 و CD10534 متوسطة بين هذه القيم. احتوى SVF الأولي على مجموعة فرعية من الخلايا الإيجابية للعلامات المرتبطة بالخلايا الجذعية (الشكل 3). عبر متوسط 79٪ من SVFs عن العلامة المرتبطة ب HSC CD3434.
في المجموع ، كانت 21 دقيقة ضرورية للغسلات الثلاث ، و 30 دقيقة لهضم الكولاجيناز ، و 10 دقائق للطرد المركزي ، و 5 دقائق لعد الخلايا والطلاء.
الشكل 1: خطوات من بروتوكول عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون . (أ) كيس لنقل الشفاطات الشحمية في نظام مغلق. (ب) تتكرر خطوة كيس الراحة ثلاث مرات بعد الغسيل. (ج) شفط الدهون بعد ثلاث غسلات باستخدام DPBS. د: الشفاطة الشحمية بعد هضم الكولاجيناز. ه: يوزع الشحوم بعد الهضم في أنبوب حجمه 50 مل. (و) الشفاطات الشحمية المهضومة بعد الطرد المركزي. (ز) عزل العملية النهائية مع الحبيبات مع الكسر الوعائي اللحمي (SVF). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مورفولوجيا وصلاحية ADSCs . (أ) الخلايا الجذعية البلاستيكية المشتقة من اللحمة المتوسطة المشتقة من اللحمة المتوسطة عند الممر الأول بعد عزلها في المجهر الضوئي. تظهر الخلايا التصاق بالتشكل البلاستيكي والخلايا الليفية. (ب) مقايسة تريبان الزرقاء التي تظهر خلايا قابلة للحياة تم عدها في غرفة نيوباور باستخدام مجهر ضوئي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: السكان الفرعيون للخلايا الموجبة للعلامات المرتبطة بالخلايا الجذعية في SVF للحالة 9 بعد 8 أشهر من الحفظ بالتبريد. R1: إجمالي المنطقة الخلوية التي تم تحليلها في FSC (التشتت الأمامي) × SSC (التشتت الجانبي) (الحجم × التعقيد) ؛ R2: المنطقة السلبية CD45 ، التي يكون سكانها CD73 و CD90 و CD105 إيجابيين في هذه المنطقة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: مقايسة التمايز . (أ) تمايز ADSC في الخلايا الغضروفية. ب: تمايز ADSC في الخلايا العظمية. ج: تمايز ADSC في الخلايا الشحمية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| صبور | العمر عند التحصيل (بالسنوات) | الوزن (كجم) | الارتفاع (متر) | مؤشر كتله الجسم* |
| الحالة 1 | 35 | 68 | 1.64 | 25.28 |
| الحالة 2 | 33 | 65 | 1.65 | 23.88 |
| الحالة 3 | 35 | 70 | 1.68 | 24.8 |
| الحالة 4 | 34 | 72 | 1.64 | 26.77 |
| القضية 5 | 36 | 72 | 1.69 | 25.21 |
| القضية 6 | 36 | 67 | 1.64 | 24.91 |
| القضية 7 | 38 | 62 | 1.53 | 26.49 |
| القضية رقم 8 | 50 | 63 | 1.68 | 22.32 |
| القضية 9 | 37 | 65 | 1.58 | 26.04 |
الجدول 1: بيانات من عينات الأفراد الذين تمت دراستهم. * مؤشر كتلة الجسم: مؤشر كتلة الجسم.
| صبور | الحجم الذي تم جمعه (مل) | SVF العائد الخلوي (خلية / مل) (x 105) | الحجم في الثقافة (مل) | متوسط النسبة المئوية ل ADSC المؤكدة (٪) | عدد الخلايا في الثقافة الأولية (x 105) | العدد التقديري ل ADSC في الثقافة (x 105) | أيام إلى P1 | العائد الخلوي قبل الانتقال إلى P1 (x 105) |
| الحالة 1 | 96 | 9.2 | 2 | غير متوفر | 18.4 | غير متوفر | 10 | 18 |
| الحالة 2 | 100 | 25.2 | 1 | 38 | 25.2 | 9.6 | 12 | 10.8 |
| الحالة 3 | 100 | 26.2 | 1 | غير متوفر | 26.2 | غير متوفر | 12 | 6.6 |
| الحالة 4 | 105 | 21.1 | 1 | 55.9 | 21.1 | 11.8 | 3 | 13.1 |
| القضية 5 | 110 | 23.7 | 1 | 61.4 | 23.7 | 14.5 | 4 | 16.1 |
| القضية 6 | 100 | 13.3 | 1.1 | 78.9 | 14.6 | 11.5 | 10 | 13.5 |
| القضية 7 | 98 | 6.8 | 2 | غير متوفر | 13.6 | غير متوفر | 8 | 10.5 |
| القضية رقم 8 | 100 | 9.7 | 1.1 | 44.2 | 10.7 | 4.7 | 11 | 6.9 |
| القضية 9 | 100 | 6.1 | 2 | 43.8 | 12.2 | 5.3 | 6 | 15.9 |
| إس دي | 3.89 | 7.81 | 0.46 | 13.75 | 5.55 | 3.53 | 3.2 | 3.79 |
الجدول 2: بيانات من خطوات مختلفة من الإجراء من المرضى التسعة الذين تم تحليلهم. SVF: جزء الأوعية الدموية اللحمية. ADSC: الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. P1: المقطع 1 ؛ NA: البيانات غير متوفرة.
| عينة | ٪ من ADSC تحددها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة | ٪ من الخلايا المكونة للدم التي تحددها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة | فحص صلاحية الخلية ووقت الحفظ بالتبريد SVF | |||||||||
| CD45- (*) | CD73+/CD90+ | CD73+/CD105+ | CD105+/CD90+ | دني | CD34+ | HLA-DR+ | CD11b + | CD19+ | حي / ميت + | |||
| الحالة 2 | 52.34% | 31.97% | 25.36% | 56.52% | 37.95% | 63.16% | 12.87% | 2.41% | 0.21% | 39.54٪ (2 سنة) | ||
| الحالة 4 | 48.02% | 61.62% | 40.93% | 65.25% | 55.93% | 82.94% | 26.62% | 0.00% | 0.16% | 38.30٪ (2 سنة) | ||
| القضية 5 | 27.74% | 54.02% | 49.72% | 80.42% | 61.38% | 73.33% | 51.31% | 0.05% | 0.00% | 23.06٪ (2 سنة) | ||
| القضية 6 | 55.52% | 79.52% | 67.70% | 89.52% | 78.91% | 86.86% | 8.83% | 0.18% | 1.06% | 56.76٪ (2 سنة) | ||
| القضية رقم 8 | 57.28% | 46.84% | 30.88% | 57.65% | 45.12% | 78.47% | 26.97% | 0.03% | 0.00% | 55.56٪ (1 سنة) | ||
| القضية 9 | 56.14% | 47.52% | 36.30% | 47.69% | 43.83% | 88.10% | 26.94% | 0.05% | 0.24% | 72.34٪ (8 أشهر) | ||
الجدول 3: بيانات قياس التدفق الخلوي من ستة من المرضى. (*) من خلايا CD45 هذه ، تم تحديد النسبة المئوية ل ADSC مع مجموعات مختلفة من علامات الخلايا الجذعية. ADSC: الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون. SVF: جزء الأوعية الدموية اللحمية. (*) من خلايا CD45 هذه ، تم تحديد النسبة المئوية ل ADSC مع مجموعات مختلفة من علامات الخلايا الجذعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عائد العزلة
من الثابت أن عملية الحفظ بالتبريد ، المطلوبة بشكل متكرر في العلاج الخلوي ، تؤدي إلى فقدان كبير للخلايا ، وأحيانا أكبر من 50٪ 29،30،35. وبالتالي ، فإن التحسين التقني للحصول على عائد خلوي أولي مرتفع بمعزل عن غيره أمر أساسي. يجب أن تركز طريقة جمع شفط الدهون وطريقة عزل الخلايا على الحفاظ على عدد أكبر من الخلايا ، والحفاظ على قابلية عالية للحياة ، واستخراج أكبر عدد ممكن من الخلايا من المادة الأولية مع حساب الثقافة والتلاعب بالخلايا على المدى الطويل. لذلك ، يلزم صيانة الثقافة المستقيمة لإبعاد الخلايا عن موت الخلايا المبرمج أو الشيخوخة أو عدم الاستقرار الجيني ، حيث من المحتمل أن يكون العلاج بالخلايا فعالا وآمنا للمرضى.
على حد علمنا ، لا توجد مقالة سابقة تستخدم هذه المجموعة من الخطوات لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من شفط الدهون ، مما يؤدي إلى تقنية موفرة للوقت والتكلفة والفائدة. في هذه الدراسة ، تم تفسير كل خطوة منهجية وفقا للأدبيات التي أظهرت أعلى عائد نهائي للخلية في العزل الخلوي. كانت حداثة التقنية التي أجريت في هذه الدراسة هي استخدام الشفط اليدوي المرتبط بسلسلة من غسولات شفط الدهون ، مع استراحة الكيس اللاحقة. سمحت حقيبة التجميع المستخدمة لنقل ومعالجة شفاطات الدهون لشظايا الأنسجة غير المهضومة بعدم المشاركة في هضم الكولاجيناز. الخطوة الأكثر أهمية هي إضافة كلوريد الكالسيوم إلى محلول الهضم الطازج لأنه يعزز عمل الكولاجيناز. لم يتم الإبلاغ عن كسب الوقت بعد في الأدبيات باستخدام طريقة إذابة الخلايا التي تسمح بخلايا قابلة للحياة حتى بعد وقت طويل من الحفظ بالتبريد. تراوح العائد الخلوي SVF الموجود في هذه الدراسة على نطاق واسع من 6.15 إلى 26.2 × 10 5 خلايا / مل بمتوسط 15.7 × 105 خلايا / مل. قد يكون هذا بسبب وجود كمية أكبر من محلول الأدرينالين الذي تم شفطه ، والذي قد يكون أعلى أو أقل وفقا لمرحلة الإجراء الجراحي وعدد أنواع الخلايا المعروفة الأخرى الموجودة بشكل عام في SVF. على الرغم من أن بعض الدراسات قد وجدت ارتباطات سلبية بين مؤشر كتلة الجسم وعائد ADSC 36,37 ، إلا أن هذه الدراسة لم تجد أي ارتباط كبير ، مثل الدراستين الأخريين 38,39 ، مما يقلل من احتمال أن يكون ذلك هو سبب التنوع المذهل للعائد الخلوي SVF الموجود في هذه الدراسة. تظهر هذه البيانات أن أقل عائد خلوي SVF تم الحصول عليه كان 6.15 × 105 خلايا / مل. قامت بعض الدراسات بالفعل بقياس كفاءة عزل كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSC) وفقا للتقنية الجراحية للحصول على شفط الدهون. حصلت إحدى الدراسات على 0.087 × 105 خلايا / مل في SVF المعزول حديثا لتقنية شفط الدهون باستخدام محلول الأدرينالين (كما هو مستخدم في هذه الدراسة) و 0.143 × 105 خلايا / مل بدونها26. سلط هذا العمل الضوء على أهمية حقن محلول الأدرينالين بسبب تأثير تضيق الأوعية الذي يقلل من النزيف والكدمات أثناء العملية ، حيث يختار غالبية الجراحين الأداء في الممارسة السريرية. أظهرت دراسة أخرى أن ADSCs الحية المعزولة تراوحت من 0 إلى 0.59 × 10 5 خلايا / جم شفيحية تم حصادها ، بمتوسط 0.295 (±0.25) × 105 خلايا / جم أنسجة31. اختبرت بعض الدراسات طرقا مختلفة لتحقيق عائد أعلى من ADSC. حققت إحدى هذه الدراسات حوالي 350 × 105 للطريقة التي قدمت مكونات مختلفة في مخزن هضم كولاجيناز واستخدام شاكر مداري40. أظهرت دراسة أخرى 29.7 (±0.2) × 105 خلايا / مل كإجمالي عدد خلايا SVF من منطقة البطن41. لا تزال منطقة البطن المختارة في هذه الدراسة هي المنطقة المرجعية لأفضل توافر وإمكانية الوصول إلى lipoaspirate42. تعد منطقة الجسم لجمع الشفاطات الشحمية ، من بين عوامل أخرى مثل عمر المتبرع وطريقة الجمع المختارة ، محددا قويا لجودة إنتاجية ADSC.
كانت إمكانية تلوث الكائنات الحية الدقيقة التي تسببت في عدم توفر الخلايا لمواصلة التجارب هي مشكلة التنفيذ الوحيدة التي حدت من إكمال هذه الدراسة. حتى باستخدام المضادات الحيوية ومتطلبات ممارسات التصنيع الجيدة ، يمكن أن يحدث التلوث بسبب عدم وجود بيئة معقمة كاملة لأداء شفط الدهون.
التنميط المناعي SVF
وفقا للجنة الخلايا الجذعية للأنسجة المتوسطة والأنسجة التابعة للجمعية الدولية للعلاج الخلوي 34 ، فإن أحد المعايير الثلاثة الدنيا لتحديد الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية هو أن الخلايا يجب أن تعبر عن CD105 34 و CD73 34 و CD90 34 ويجب ألا تعبر عن CD45 34 أو CD34 34 أو CD1434 أو CD11b 34 أو CD79a 34 أو CD19 34 ، وجزيئات غشاء سطح HLA-DR34. اختبر ميتشل43 خلايا SVF جديدة عن طريق التنميط المناعي ووجد 54٪ كحد أقصى من الخلايا ذات علامات سطح ADSC. في هذه الدراسة ، كشف التنميط المناعي عن نسبة أعلى من ADSC المؤكدة (الخلايا غير المكونة للدم) تصل إلى 78.91٪ في SVF بعد الحفظ بالتبريد على المدى الطويل (تتراوح من 37.95٪ -78.91٪ بمتوسط 53.68٪). تشير الأدلة إلى أن أسلاف مجموعة الخلايا الجذعية التي لم تلتزم بعد لا تعبر عن علامة CD3434،44،45. اعتمادا على مرحلة التمايز ، يمكن للخلايا الجذعية السلبية CD3434 أن تولد ليس فقط أسلاف المكونة للدم ولكن أيضا سلائف اللحمة المتوسطة الأكثر تحديدا ، مثل الخلايا العظمية ، والخلايا الغضروفية ، والخلايا العضلية ، والخلايا الشحمية ، وغيرها. أظهرت بعض الدراسات اللدونة المذهلة لمجموعة الخلايا الجذعية البدائية ، المكونة من خلايا ذات وظيفة خلية انسجة وأسلاف المكونة للدم واللحمة المتوسطة45. وفقا للأدبيات ، لا يزال الدور الوظيفي الكامل CD3434 في تكوين الأنسجة في خلايا SVF غير معروف46. أظهر ميتشل43 متوسط 60٪ من خلايا SVF معبرا عن علامة CD3434 ، بينما في هذه الدراسة ، كان المتوسط 78.81٪. من المعروف أن التعبير عن علامة سطح CD3434 يتناقص على طول الممرات.
الخلايا الملتصقة ومقايسة التمايز
اعتمادا على عدد الخلايا التي تم الحصول عليها بعد العزلة ، اختلف عدد الخلايا المزروعة في الثقافة الأولى. استغرق وقت الاستزراع الأول للوصول إلى التقاء 80٪ -90٪ في قارورة 75 سم2 في المتوسط 8.4 أيام وانحراف معياري قدره 7.5 (±4.5) يوما يتراوح من 6.6 إلى 16.1 × 105 خلايا / مل. وتجدر الإشارة إلى أنه حتى بالنسبة للحالات ذات العائد الخلوي المنخفض ، أدى وقت الاستزراع الأول إلى ارتفاع مؤشرات العائد الخلوي مقارنة بالأدبيات ، ربما بسبب أفضل توافر للخلايا القابلة للحياة التي تم الحفاظ عليها خلال عملية الجمع والعزل بأكملها. حصلت إحدى الدراسات على عائد خلوي قدره 3.75 (±1.42) × 105 ADSC لكل مل من شفعيط شحم خلال فترة زراعة 4.1 (±0.7) يوم47. أظهرت دراسة أخرى إنتاجية خلايا SVF النواة 3.08 (±1.40) × 105 لكل ملليمتر بمتوسط 6.0 (±2.4) يوما في فترة الاستزراع الأولى43. في هذه الدراسة ، من خلال تقدير عدد ADSC المصنف في الثقافة ، والذي اختلف كدالة لعدد الخلايا التي لوحظت في SVF من جمع نفس الحجم من 100 مل من شفط الدهون ، تم التحقق من أن عدد الأيام للوصول إلى P1 لا علاقة له بحجم الخلية. على سبيل المثال ، بالنسبة للحالة 9 ، حيث تم تحضين 12.2 × 105 خلايا ، كانت هناك حاجة إلى 6 أيام للوصول إلى التقاء 80٪ -90٪. بالنسبة للحالة 6 ، حيث تم زرع 14.6 × 105 خلايا في المزرعة ، كان من الضروري وجود فترة أطول (10 أيام) للوصول إلى نفس المستوى من التقاء. ربما يكون الحد الأدنى لعدد ADSC كافيا لفترة الالتصاق الأولى. قد يكون هناك تباين كبير بين الأفراد ، مثل الأمراض المصاحبة والعمر والحالة الصحية العامة. شككت بعض الدراسات في الأدبيات في أهمية النظر في التباين الفردي للمرضى لإنتاجية خلايا SVF48,49.
وفقا للجنة الخلايا الجذعية للنسيجة المتوسطة والأنسجة التابعة للجمعية الدولية للعلاج الخلوي34 ، يجب أن تتمتع الخلايا الوسيطة بالقدرة على التمايز إلى ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا مثل سلالات عظمية وأديبوجينية وكوندروجينية كما هو موضح في الشكل 4.
صلاحية الخلية ، والحفظ بالتبريد ، وعدم الاستقرار الجيني
تم استخدام طرق مختلفة لتحديد فقدان الجدوى ، والتي تعرف بأنها تلف سلامة غشاء البلازما50. ومع ذلك ، يمكن أن تقدم الثقافات أيضا خلايا موت الخلايا المبرمج المبكرة التي يمكن لهذه الأساليب تجاهلها لأنها تحافظ على غشاء بلازما سليم ، لكنها غير قابلة للحياة. تظهر النتائج المبلغ عنها هنا نطاقا كبيرا في علامة الجدوى ، من 23.06٪ إلى 72.34٪ ، بمتوسط 47.6٪ بعد الحفظ بالتبريد على المدى الطويل. بالنظر إلى أن الحفظ بالتبريد هو خطوة مهمة فيما يتعلق بالعلاج بالخلايا ، فإن استعادة أكبر عدد ممكن من الخلايا الجذعية القابلة للحياة والوظيفية بعد الذوبان هي واحدة من القضايا ذات الأولوية لنجاح العلاج الخلوي. أظهرت الأدبيات أن ما لا يقل عن 50٪ من صلاحية الخلية تضيع من 1-4 أشهر بعد الحفظ بالتبريد43. والجدير بالذكر أن أدنى المؤشرات المقدمة في هذه الدراسة هي من الحالات 5 والحالة 4 والحالة 2 ، وهي أقدم العينات المحفوظة بالتبريد (حوالي عامين). على الرغم من أنهم قدموا أدنى مؤشرات الجدوى ، إلا أنهم أظهروا إنتاجية خلوية عالية في مقايسة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء في SVF الطازجة. على الرغم من أن الأدبيات تدعم أسباب فقدان الجدوى ، إلا أن هذه المعدلات أقل من المتوقع. يمكن أن تتسبب تقلبات درجات الحرارة في تخزين الخلايا لأسباب فنية في زيادة وتراكم الإجهاد وتفضيل تراكم الأجزاء المائية ، مما يؤدي إلى توليد بلورات تلحق الضرر بالغشاء البلازمي أثناء الحفظ بالتبريد على المدى الطويل51. تظهر الأدبيات أكثر من 70٪ من الصلاحية للعينات التي لها نفس وقت التجميد أو أطول. ومع ذلك ، تم إجراء فحص الجدوى بتقنية مختلفة عن تلك التي أجريت في هذه الدراسة52. أظهرت دراسة أخرى أن الحفظ بالتبريد لفترة أطول يؤثر سلبا على الصلاحية الخلوية31 ، والتي يمكن تفسيرها بتغيرات درجة الحرارة في الفريزر -80 درجة مئوية. وبالتالي ، غالبا ما تحتاج الخلايا إلى البقاء لفترة طويلة في الثقافة ، مما يزيد من إجهاد دورة الخلية ، مما يؤدي إلى مخاطر عدم الاستقرار الجيني وبالتالي تعريض العلاج الخلوي للخطر. هناك أيضا إجماع في الأدبيات يشير إلى بعض عوامل الإجهاد وكيف تؤثر على الاستقرار الوراثي الخلوي للخلايا ، وهو أمر ضروري للحفاظ على زراعة الخلايا الجذعية لفترات طويلة المطلوبة للعلاج بالخلايا35,53.
فائدة المنهجية
حتى الآن، لا تظهر الأدبيات أي بروتوكول موحد لعزل ADSC بهدف التطبيقات السريرية. تظهر معظم الدراسات بروتوكولات معقدة وتستغرق وقتا طويلا24. في هذه الدراسة ، يجب التأكيد على كفاءة الطريقة مقابل الوقت المطلوب لإكمال العائد الخلوي الأولي: حوالي 1.5 ساعة. وفقا للأدبيات ، يمكن أن يستغرق عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون حوالي 3 ساعات إلى 8 ساعات54,55. وبالتالي ، فإن كسب الوقت المتحالف مع الدخل الخلوي المرتفع أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات الطب التجديدي. يجب إجراء المزيد من تقييمات صلاحية الخلية بالتوازي مع تلك التي يتم إجراؤها في هذا العمل لتحسين هذه الطريقة. هناك حاجة إلى مزيد من التجارب المعشاة ذات الشواهد التي تتضمن عينة أكثر شمولا باستخدام هذه المنهجية للتوقيع على هذه النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نشكر المرضى الذين تطوعوا للمشاركة والطاقم الطبي والتمريضي في مستشفى ساو باولو. تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة أمبارو في بيسكيزا دو إستادو دي ساو باولو (FAPESP) والمجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجيا (CNPq) ، البرازيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL cryovials | Nunc Thermo Fisher Scientific | 340711 | |
| 150 mL polyvinyl chloride transfer bag | JP FARMA | 80146150059 | |
| 2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 | Sigma Aldrich | A5533 | |
| Adrenaline (1 mg/mL) | Hipolabor | NA | |
| Alcian Blue solution | Sigma Aldrich | 1,01,647 | |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Gibco | 15240062 | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis | BD BioSciences | NA | |
| Calcium chloride 10% | Merck | 102379 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | VIC PHARMA | NA | |
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17018029 | |
| DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Gibco | 11966025 | |
| DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285801 | |
| DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) | Gibco | A1285601 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| Formaldehyde 4% | Sigma Aldrich | 1,00,496 | |
| Inverted light microscope | Nikon Eclipse TS100 | NA | |
| Live and Dead Cell Assay | Thermofisher | 01-3333-41 | 01-3333-42 | |
| Monoclonal antibody: CD105 | BD BioSciences | 745927 | |
| Monoclonal antibody: CD11B | BD BioSciences | 746004 | |
| Monoclonal antibody: CD19 | BD BioSciences | 745907 | |
| Monoclonal antibody: CD34 | BD BioSciences | 747822 | |
| Monoclonal antibody: CD45 | DAKO | M0701 | |
| Monoclonal antibody: CD73 | BD BioSciences | 746000 | |
| Monoclonal antibody: CD90 | BD BioSciences | 553011 | |
| Monoclonal antibody: HLA-DR | BD BioSciences | 340827 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007001 | |
| StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007101 | |
| StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Gibco | A1007201 | |
| Sterile connector with one spike with needle injection site | Origen Biomedical Connector, USA | NA | Code mark: IBS |
| Trypan blue solution 0.4% | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose tissue-derived stem cells in regenerative medicine. Transfusion Medicina and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Alperovich, M., et al. Adipose stem cell therapy in cancer reconstruction: a critical review. Annals of Plastic Surgery. 73, Suppl 1 104-107 (2014).
- Forcales, S. V. Potential of adipose-derived stem cells in muscular regenerative therapies. Frontiers in Aging Neuroscience. 7, 123 (2015).
- Bateman, M. E., Strong, A. L., Gimble, J. M., Bunnell, B. A. Concise review: using fat to fight disease: a systematic review of nonhomologous adipose-derived stromal/stem cell therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Gentile, P., Cervelli, V. Adipose-derived stromal vascular fraction cells and platelet- rich plasma: basic and clinical implications for tissue engineering therapies in regenerative surgery. Methods in Molecular Biology. 1773, 107-122 (2018).
- Schäffler, A., Büchler, C. Concise review: adipose tissue-derived stromal cells- basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells. 25 (4), 818-827 (2007).
- Witkowska-Zimny, M., Walenko, K. Stem cells from adipose tissue. Cellular & Molecular Biology Letters. 16, 236-257 (2011).
- Liew, L. J., Ong, H. T., Dilley, R. J. Isolation and culture of adipose-derived stromal cells from subcutaneous fat. Methods in Molecular Biology. 1627, 193-203 (2017).
- Fazzina, R., et al. Potency testing of mesenchymal stromal cell growth expanded in human platelet lysate from different human tissues. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 122 (2016).
- Yarak, S., Okamoto, O. K. Human adipose-derived stem cells: Current challenges and clinical perspectives. Brazilian Annals of Dermatology. 85 (5), 647-656 (2010).
- Mizuno, H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration: ten years of research and a literature review. Journal of Nippon Medical School. 76 (2), 56-66 (2009).
- Makarov, A. V., Arutyunyan, I. V., Bol'Shakova, G. B., Volkov, A. V., Gol'Dshtein, D. V. Morphological changes in paraurethral area after introduction of tissue engineering constructo on the basis of adipose tissue stromal cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 148 (4), 719-724 (2009).
- Simonacci, F., Bertozzi, N., Raposio, E. Off-label use of adipose-derived stem cells. Annals of Medicina and Surgery. 24, 44-51 (2017).
- Scanarotti, C., et al. Neurogenic-committed human pre-adipocytes express CYP1A isoforms. Chemico-Biological Interactions. 184 (3), 474-483 (2010).
- Aluigi, M. G., et al. Pre-adipocytes commitment to neurogenesis 1: Preliminary localisation of cholinergic molecules. Cell Biology International. 33 (5), 594-601 (2009).
- Coradeghini, R., et al. A comparative study of proliferation and hepatic differentiation of human adipose-derived stem cells. Cells Tissues Organs. 191 (6), 466-477 (2010).
- Xishan, Z., et al. Jagged-2 enhances immunomodulatory activity in adipose derived mesenchymal stem cells. Scientific Reports. 5, 14284 (2015).
- Debnath, T., Chelluri, L. K. Standardization and quality assessment for clinical grade mesenchymal stem cells from human adipose tissue. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 7-16 (2019).
- El-Sayed, M., et al. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells: Cell origin and cell quality variations. Molecular Biology Reports. 46 (1), 1157-1165 (2019).
- Harasymiak-Krzyzanowska, I., et al. Adipose tissue-derived stem cells show considerable promise for regenerative medicine applications. Cellular & Molecular Biology Letters. 18 (4), 479-493 (2013).
- Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 269-291 (2011).
- US National Institutes of Health Website. , Available from: https://clinicaltrials.gov/ (2019).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: Tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012, 812693 (2012).
- Raposio, E., Bertozzi, N. Isolation of ready-to-use adipose-derived stem cell (ASC) pellet for clinical applications and a comparative overview of alternate methods for ASC isolation. Current Protocols in Stem Cell Biology. 41, 1-12 (2017).
- Cucchiani, R., Corrales, L. The effects of fat harvesting and preparation, air exposure, obesity, and stem cell enrichment on adipocyte viability prior to graft transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 36 (10), 1164-1173 (2016).
- Muscari, C., et al. Comparison between stem cells harvested from wet and dry lipoaspirates. Connective Tissue Research. 54 (1), 34-40 (2013).
- Bora, P., Majumdar, A. S. Adipose tissue-derived stromal vascular fraction in regenerative medicine: a brief review on biology and translation. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 145 (2017).
- Zanata, F., et al. Effect of cryopreservation on human adipose tissue and isolated stromal vascular fraction cells: in vitro and in vivo analyses. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), (2018).
- Harris, D. Long-term frozen storage of stem cells: challenges and solutions. Journal of Biorepository Science for Applied Medicina. 4, 9-20 (2016).
- Minonzio, G., et al. Frozen adipose-derived mesenchymal stem cells maintain high capability to grow and differentiate. Cryobiology. 69 (2), 211-216 (2014).
- Devitt, S. M., et al. Successful isolation of viable adipose-derived stem cells from human adipose tissue subject to long-term cryopreservation positive implications for adult stem cell-based therapeutics in patients of advanced age. Stem Cells International. 2015, 146421 (2015).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. 3rd Ed. , Wiley-Liss. New York. (2001).
- Spearman's Rho Calculator. , Available from: https://www.socscistatistics.com/tests/spearman/ (2020).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Irioda, A. C., et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells cryopreservation and thawing decrease α4-integrin expression. Stem Cells International. 2016, 2562718 (2016).
- Aust, L., et al. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates. Cytotherapy. 6 (1), 7-14 (2004).
- Pérez, L. M., et al. Altered metabolic and stemness capacity of adipose tissue-derived stem cells from obese mouse and human. PLoS One. 10 (4), 0123397 (2015).
- Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. Journal of Cellular Physiology. 208 (1), 64-76 (2006).
- Mojallal, A., et al. Influence of age and body mass index on the yield and proliferation capacity of adipose-derived stem cells. Aesthetic Plastic Surgery. 35 (6), 1097-1105 (2011).
- Tevlin, R., et al. A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (6), (2016).
- Tsekouras, A., et al. Comparison of the viability and yield of adipose-derived stem cells (ASCs) from different donor areas. In Vivo. 31 (6), 1229-1234 (2017).
- Varghese, J., Griffin, M., Mosahebi, A., Butler, P. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: implications for regenerative therapy. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 45 (2017).
- Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
- Huss, R. Perspectives on the morphology and biology of CD34-negative stem cells. Journal of Hematotherapy and Stem Cell Research. 9 (6), 783-793 (2000).
- Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics (IFATS) and Science and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
- Scherberich, A., Di Maggio, N., Mcnagny, K. M. A familiar stranger: CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue. World Journal of Stem Cells. 5 (1), 1-8 (2013).
- Yu, G., et al. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes. Cytotherapy. 12 (4), 538-546 (2010).
- Meyerrose, T. E., et al. In vivo distribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells in novel xenotransplantation models. Stem Cells. 25 (1), 220-227 (2007).
- Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regenerative Medicina. 3 (5), 705-715 (2008).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Defining viability in mammalian cell cultures Defining viability in mammalian cell cultures. Biotechnolology Letters. 33, 1745-1749 (2011).
- Pogozhykh, D., et al. Influence of temperature fluctuations during cryopreservation on vital parameters, differentiation potential, and transgene expression of placental multipotent stromal cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 66 (2017).
- Shaik, S., Wu, X., Gimble, J., Devireddy, R. Effects of decade long freezing storage on adipose derived stem cells functionality. Scientific Reports. 8 (1), 8162 (2018).
- Weissbein, U., Benvenisty, N., Ben-David, U. Genome maintenance in pluripotent stem cells. Journal of Cell Biology. 204 (2), 153-163 (2014).
- Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
- Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human Adipose-Derived Stem Cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897 (2018).
