טכניקה לקבלת תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן ואפיון שבר כלי דם סטרומלי בשימור בהקפאה ארוכת טווח

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה משופרת לבידוד ADSC וכתוצאה מכך תפוקה תאית אדירה עם רווח בזמן בהשוואה לספרות. מחקר זה מספק גם שיטה פשוטה להשגת מספר גדול יחסית של תאים בני קיימא לאחר שימור בהקפאה לטווח ארוך.

Abstract

תאי גזע מזנכימליים אנושיים שמקורם ברקמת שומן הפכו לאטרקטיביים יותר ויותר ככל שהם מראים תכונות מתאימות ומהווים מקור נגיש ליישומים קליניים רגנרטיביים. פרוטוקולים שונים שימשו להשגת תאי גזע שמקורם בשומן. מאמר זה מתאר שלבים שונים של פרוטוקול משופר לחיסכון בזמן כדי להשיג כמות משמעותית יותר של ADSC, ומראה כיצד לשמר ולהפשרה של ADSC כדי להשיג תאים בני קיימא להרחבת התרבית. מאה מיליליטר של lipoaspirate נאספו, באמצעות 26 ס”מ שלושה חורים ו 3 מ”מ מזרק שאיבת שומן, מאזור הבטן של תשעה חולים שעברו לאחר מכן abdominoplasty אלקטיבי. בידוד תאי הגזע בוצע באמצעות סדרה של שטיפות עם תמיסת מלח חצוב פוספט (DPBS) של דולבקו, בתוספת סידן ושימוש בקולגן. תאי שבר כלי דם סטרומליים (SVF) הוקפאו, ויכולת הקיום שלהם נבדקה על ידי אימונופנוטיפ. התפוקה התאית של SVF הייתה 15.7 x 10^{5 תאים} למ”ל, ונעה בין 6.1-26.2 תאים למ”ל. תאי SVF דבקים הגיעו למפגש לאחר ממוצע של 7.5 (±4.5) ימים, עם תפוקה תאית ממוצעת של 12.3 (± 5.7) x 10^{5 תאים} למ”ל. הכדאיות של SVF מופשר לאחר 8 חודשים, שנה ושנתיים נעה בין 23.06%-72.34% עם ממוצע של 47.7% (±24.64) עם הכדאיות הנמוכה ביותר בקורלציה עם מקרים של הקפאה של שנתיים. השימוש בתמיסת DPBS בתוספת סידן וזמני מנוחה של שקיות למשקעי שומן עם זמן קצר יותר של עיכול קולגן הביא לתפוקה מוגברת של התאים הסופיים של תאי גזע. ההליך המפורט להשגת תשואות גבוהות של תאי גזע בני קיימא היה יעיל יותר לגבי זמן ותפוקת תאים מאשר הטכניקות ממחקרים קודמים. גם לאחר תקופה ארוכה של שימור בהקפאה, נמצאו תאי ADSC בני קיימא ב-SVF.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים אנושיים הם יתרון הן במחקר בסיסי והן במחקר יישומי. השימוש בסוג תא בוגר זה גובר על סוגיות אתיות – בהשוואה לשימוש בתאים עובריים או אחרים – בהיותו אחד מתחומי המחקר המבטיחים ביותר בהנדסת התחדשות רקמות אוטולוגית^וטיפול בתאים 1, כגון האזור הניאופלסטי, הטיפול במחלות ניווניות ויישומים טיפוליים באזור הניתוח המשחזר ^{2,3,4, 5}. בעבר דווח כי קיים מקור שופע של תאי גזע רב-פוטנטיים ופלוריפוטנטיים מזנכימליים בחלק תאי כלי הדם הסטרומליים של רקמת השומן ^6,7. ADSC אלה נחשבים למועמדים מצוינים לשימוש בטיפול בתאים והשתלה / עירוי מכיוון שניתן להשיג בקלות מספר לא מבוטל של תאים עם יכולת הרחבה ex vivo עם תשואה גבוהה מהליך זעיר פולשני ^5,8.

כמו כן, הוכח כי רקמת השומן מציגה יכולת גדולה יותר לספק תאי גזע מזנכימליים מאשר שני מקורות אחרים (מח עצם ורקמת חבל הטבור)⁹. מלבד היותו אימונוגני גרוע ובעל יכולת גבוהה להשתלב ברקמה המארחת ולתקשר עם הרקמות הסובבות^4,10, ל- ADSC יש יכולת רב-תכליתית של התמיינות לקווי תאים, עם דיווחים על התמיינות כונדרוגנית, אוסטאוגנית ומיוגנית בתנאי תרבית מתאימים^11,12,13, ולתוך תאים, כגון לבלב, הפטוציטים^, ותאים נוירוגניים^14,15,16.

הקהילה המדעית מסכימה כי האפקט החיסוני של תאי גזע מזנכימליים הוא מנגנון פעולה רלוונטי יותר לטיפול בתאים^17,18,19 מאשר תכונת ההתמיינות שלהם. אחד היתרונות המשמעותיים ביותר של השימוש ב- ADSC הוא האפשרות של עירוי אוטולוגי או השתלה, להיות טיפול חלופי למספר מחלות. עבור רפואה רגנרטיבית, ADSC כבר שימשו במקרים של נזק לכבד, שחזור של שריר הלב, התחדשות של רקמת עצבים, שיפור תפקוד שרירי השלד, התחדשות העצם, טיפול בסרטן, וטיפול בסוכרת^20,21.

נכון להיום, ישנם 263 ניסויים קליניים רשומים להערכת הפוטנציאל של ADSC, המפורטים באתר האינטרנט של המכונים הלאומיים לבריאות של ארצות הברית²². פרוטוקולים שונים לקצירת רקמת שומן נקבעו, אך אין קונצנזוס בספרות על שיטה סטנדרטית לבידוד ADSC לשימוש קליני^23,24. שיטות עיבוד Lipoaspirate במהלך הניתוח ולאחריו יכולות להשפיע ישירות על כדאיות התא, על התפוקה התאית הסופית²⁵, ועל איכות אוכלוסיית ADSC²⁰. באשר לטיפול המקדים הניתוחי, לא ברור איזו טכניקת טרום-טיפול כירורגית מניבה מספר משמעותי יותר של תאים בני קיימא לאחר הבידוד או שמא תמיסת ההרדמה המוזרקת לרקמת השומן משפיעה על תפוקת התא ועל תפקודו²⁶. באופן דומה, ההבדל בין טכניקות להשגת תאי שומן יכול להוביל לירידה של עד 70% במספר ADSC²⁰ בר קיימא. על פי הספרות, יש להימנע מטיפולים מכניים להשגת אוכלוסיות תאים עם כדאיות גבוהה – כולל אולטרסאונד, שכן הם יכולים לפרק את רקמת השומן²⁰. עם זאת, שיטת שאיפת השומן הידנית עם מזרקים מזיקה פחות, וגורמת לפחות הרס תאים, כאשר שאיבת שומן סרטנית מניבה מספר משמעותי של תאים באיכות הטובה ביותר²⁶.

טכניקה זו משתמשת בתמיסת מלח עם לידוקאין ואפינפרין המוזרק לאזור שאיבת השומן. עבור כל נפח 3 מ”ל של תמיסה מוזרק, 1 מ”ל הוא aspirated. במחקר זה בוצעה טכניקת שאיבת השומן הרטובה, שבה עבור כל 1 מ”ל של אדרנלין ותמיסת מלח מוזרקת, 0.2 מ”ל של רקמת שומן הוא שאפתן. השימוש באנזימי עיכול, במיוחד קולגן, נפוץ בתהליך בידוד ADSC.

לאחר שלב הבידוד הראשון במעבדה, הכדור הסופי נקרא שבר כלי דם סטרומלי (SVF). הוא מכיל סוגי תאים שונים²⁷, כולל תאים מבשרי אנדותל, תאי אנדותל, מקרופאגים, תאי שריר חלק, לימפוציטים, פריציטים, קדם-אדיפוציטים ו- ADSCs, המסוגלים להידבק. לאחר סיום הבידוד הסופי מתרביות מבחנה , תאים שלא דבקו בפלסטיק מסולקים בחילופים בינוניים. לאחר שמונה שבועות של התרחבות, שינויים בינוניים ומעברים, ADSCs מייצגים את רוב אוכלוסיית התאים בבקבוקונים²⁰. אחד היתרונות המשמעותיים ביותר של שימוש בתאי גזע בודדים שמקורם בשומן לטיפול עתידי אפשרי הוא האפשרות של שימור בהקפאה. הודגם כי ליפואספירציה בהקפאה היא מקור פוטנציאלי לתאי SVF גם לאחר 6 שבועות של הקפאה²⁸, עם פעילות ביולוגית גם לאחר שנתיים של שימור בהקפאה²⁹, ויכולת מלאה לגדול ולהתמיין בתרבית³⁰. עם זאת, במהלך תהליך ההפשרה, אחוז ניכר של תאים הוא איבד בדרך כלל³¹. לכן, תהליך הסרת lipoaspirate ואת השיטות הבאות של בידוד התא חייב להבטיח את תפוקת התא הגבוהה ביותר.

מחקר זה מתאר מתודולוגיה מהירה יותר לאיסוף ובידוד ADSC, המדגימה תפוקה תאית גבוהה וכדאיות ליעילות טובה יותר של טיפולים תאיים. יתר על כן, ההשפעה של טכניקה משופרת זו לאחר שימור בהקפאה ארוך טווח של SVF נבדקה.

Protocol

המחקר הנוכחי מאושר על ידי ועדת האתיקה של UNIFESP (מספר פרוטוקול: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), שבוצע לאחר קבלת הסכמה מדעת בכתב מהמטופלים על פי הצהרת הלסינקי (2004). המדגם של המחקר הנוכחי מורכב מתשע מטופלות, בגילאי 33-50 שנים (גיל ממוצע 41.5) ומדד מסת גוף ראשוני ממוצע (BMI) של 24.54 (נע בין 22.32-26.77) (טבלה 1) שעב?…

Representative Results

האפיון של תשעת הפרטים שנחקרו, כולל גילם, משקלם, גובהם ו-BMI, מוצגים בטבלה 1. על פי התפוקה התאית שהוצגה בתחילה, נפח התאים שחוסנו בתרבית חושב להיות קרוב ככל האפשר לקיבולת של בקבוק תרבית2 75 ס”מ. נפח הדגימה שנזרע בכל מקרה מתואר בטבלה 2. לאחר מכן, על פי התפוקה הת?…

Discussion

תשואת בידוד
ידוע כי תהליך ההקפאה, הנדרש לעתים קרובות בטיפול תאי, גורם לאובדן תאים משמעותי, לעתים גדול מ-50%29,30,35. לפיכך, שיפור טכני להשגת תפוקה סלולרית ראשונית גבוהה בבידוד הוא בסיסי. שיטת האיסוף של lipoaspirate ושיטת הבידוד של התאים חי?…

Materials

1.8 mL cryovials	Nunc Thermo Fisher Scientific	340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag	JP FARMA	80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2	Sigma Aldrich	A5533
Adrenaline (1 mg/mL)	Hipolabor	NA
Alcian Blue solution	Sigma Aldrich	1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x	Gibco	15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis	BD BioSciences	NA
Calcium chloride 10%	Merck	102379
Chlorhexidine gluconate 4%	VIC PHARMA	NA
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)	Gibco	11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)	Gibco	A1285601
Fetal bovine serum	Gibco	10500056
Formaldehyde 4%	Sigma Aldrich	1,00,496
Inverted light microscope	Nikon Eclipse TS100	NA
Live and Dead Cell Assay	Thermofisher	01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105	BD BioSciences	745927
Monoclonal antibody: CD11B	BD BioSciences	746004
Monoclonal antibody: CD19	BD BioSciences	745907
Monoclonal antibody: CD34	BD BioSciences	747822
Monoclonal antibody: CD45	DAKO	M0701
Monoclonal antibody: CD73	BD BioSciences	746000
Monoclonal antibody: CD90	BD BioSciences	553011
Monoclonal antibody: HLA-DR	BD BioSciences	340827
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4	Gibco	10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Gibco	A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site	Origen Biomedical Connector, USA	NA	Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4%	Sigma Aldrich	93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red	Gibco	25200056