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Medicine

지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 얻는 기술 및 장기 냉동 보존에서 기질 혈관 분획 특성 분석

Published: December 30, 2021
doi:
10.3791/63036
, , , , , , ,
1Genetics Division,Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2TechLife Biotech,São Lucas Cell Therapy Group, 3Division of Plastic Surgery,Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)

Summary

본 프로토콜은 ADSC 단리를 위한 개선된 방법론을 기술하여 문헌에 비해 시간 이득과 함께 엄청난 세포 수율을 초래한다. 이 연구는 또한 장기 동결보존 후 비교적 많은 수의 생존 가능한 세포를 얻기 위한 간단한 방법을 제공합니다.

Abstract

지방 조직에서 유래한 인간 중간엽 줄기세포는 적절한 특징을 보여주고 재생 임상 적용을 위한 접근 가능한 공급원이 됨에 따라 점점 더 매력적이 되고 있습니다. 지방 유래 줄기 세포를 얻기 위해 다른 프로토콜이 사용되었습니다. 이 기사에서는 더 많은 양의 ADSC를 얻기 위해 개선된 시간 절약 프로토콜의 여러 단계를 설명하고 배양 확장을 위한 생존 가능한 세포를 얻기 위해 ADSC를 냉동 보존 및 해동하는 방법을 보여줍니다. 26cm 3 구멍 및 3mm 구경 주사기 지방 흡입술을 사용하여 선택적 복부 성형술을받은 9 명의 환자의 복부에서 100 밀리리터의 지방 흡인물을 수집했습니다. 줄기 세포 분리는 칼슘이 보충 된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS) 용액과 콜라게나 제를 사용하여 일련의 세척으로 수행되었습니다. 기질 혈관 분획 (SVF) 세포를 냉동 보존하고 면역 표현형으로 생존력을 확인했습니다. SVF 세포 수율은 15.7 x 105 세포 / mL, 6.1-26.2 세포 / mL 범위였습니다. 부착 SVF 세포는 평균 7.5 (±4.5) 일 후에 합류에 도달했으며 평균 세포 수율은 12.3 (± 5.7) x 105 세포 / mL입니다. 8 개월, 1 년 및 2 년 후 해동 된 SVF의 생존력은 23.06 % -72.34 % 사이였으며 평균 47.7 % (±24.64)로 2 년 동결 사례와 관련하여 가장 낮은 생존력을 보였다. 칼슘이 보충 된 DPBS 용액과 콜라게나제 소화 시간이 짧은 지방 침전을위한 가방 휴식 시간을 사용하면 줄기 세포의 최종 세포 수율이 증가했습니다. 생존 가능한 줄기 세포의 높은 수율을 얻기위한 상세한 절차는 이전 연구의 기술보다 시간과 세포 수율과 관련하여 더 효율적이었습니다. 장기간의 동결 보존 후에도 SVF에서 생존 가능한 ADSC 세포가 발견되었습니다.

Introduction

인간 중간엽 줄기세포는 기초 및 응용 연구 모두에서 유리합니다. 이 성체 세포 유형의 사용은 배아 또는 다른 세포의 사용과 비교하여 윤리적 문제를 능가하며, 신생물 영역, 퇴행성 질환 치료 및 재건 수술 영역의 치료 응용 분야와 같은자가 조직 재생 공학 및 세포 치료1에서 가장 유망한 연구 분야중 하나입니다 2,3,4, 5. 지방 조직의 기질 혈관 세포 분획에 중간엽 다능성 및 만능 줄기 세포의 풍부한 공급원이 있다고 이전에 보고되었습니다 6,7. 이러한 ADSC는 최소 침습적 절차5,8에서 높은 수율로 생체 외 확장 능력을 가진 상당한 수의 세포를 쉽게 얻을 수 있기 때문에 세포 치료 및 이식/주입에 사용하기에 훌륭한 후보로 간주됩니다.

또한 지방 조직은 다른 두 가지 공급원(골수 및 탯줄 조직)보다 중간엽 줄기 세포를 제공할 수 있는 더 큰 능력을 제공한다는 것이 입증되었습니다9. ADSC는 면역원성이 낮고 숙주 조직에 통합되고 주변 조직과 상호 작용하는 능력이 높을 뿐만 아니라4,10, 적절한 배양 조건11,12,13 및 췌장, 간세포와 같은 세포로의 연골성, 골인성 및 근원성 분화에 대한 보고와 함께 세포주로의 분화 다분화능을 가지고 있습니다. 및 신경성 세포14,15,16.

과학계는 중간엽 줄기세포의 면역 조절 효과가 분화 특성보다 세포 치료17,18,19에 더 관련성이 높은 작용 메커니즘이라는 데 동의합니다. ADSC 사용의 가장 중요한 장점 중 하나는이 자가 주입 또는 이식의 가능성으로 여러 질병에 대한 대체 치료법이됩니다. 재생 의학의 경우 ADSC는 이미 간 손상, 심장 근육 재건, 신경 조직 재생, 골격근 기능 개선, 뼈 재생, 암 치료 및 당뇨병 치료20,21의 경우에 사용되었습니다.

현재까지 ADSC의 잠재력 평가를 위해 등록 된 임상 시험은 263 건이며 미국 국립 보건원22 웹 사이트에 나와 있습니다. 지방 조직을 수확하기위한 다른 프로토콜이 확립되었지만, 임상 사용을 위해 ADSC를 분리하는 표준화 된 방법에 대한 문헌에는 합의가 없다23,24. 수술 중 및 수술 후의 지방 흡인 처리 방법은 세포 생존율, 최종 세포 수율25 및 ADSC 집단20의 품질에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다. 외과적 전처리와 관련하여, 어떤 외과적 전처리 기술이 분리 후 더 많은 수의 생존 세포를 생성하는지 또는 지방 조직에 주입된 마취액이 세포 수율 및 그 기능에 영향을 미치는지 여부는 잘 확립되어 있지 않다26. 유사하게, 지방 세포를 얻기 위한 기술 사이의 차이는 생존 가능한 ADSC(20)의 수의70%만큼 감소를 초래할 수 있다. 문헌에 따르면, 초음파를 포함하여 높은 생존력을 갖는 세포 집단을 얻기위한 기계적 처리는 지방 조직(20)을 분해 할 수 있기 때문에 피해야한다. 그러나 주사기를 사용한 수동 지방 흡인 방법은 덜 해롭기 때문에 세포 파괴가 적으며 격렬한 지방 흡입술은 최고의 품질을 가진 상당한 수의 세포를 생성합니다26.

이 기술은 지방 흡입 부위에 주입되는 리도카인과 에피네프린이 함유 된 식염수를 사용합니다. 주입 된 용액 3mL 부피마다 1mL가 흡인됩니다. 이 연구에서는 아드레날린과 식염수 1mL를 주입 할 때마다 0.2mL의 지방 조직을 흡인하는 습식 지방 흡입 기술을 수행했습니다. 소화 효소, 특히 콜라게나 제의 사용은 ADSC를 분리하는 과정에서 일반적입니다.

실험실에서 첫 번째 분리 단계 후 최종 펠릿을 기질 혈관 분획(SVF)이라고 합니다. 그것은 내피 전구체 세포, 내피 세포, 대식세포, 평활근 세포, 림프구, 혈관주위세포, 예비지방세포 및 ADSC를 포함하는, 부착이 가능한 상이한 세포 유형(27)을 함유한다. 시험관 내 배양에서 최종 분리가 완료되면 플라스틱에 부착되지 않은 세포는 배지 교환에서 제거됩니다. 8주간의 팽창, 배지 변화, 및 계대 배양 후, ADSC는 플라스크(20) 내의 대부분의 세포 집단을 나타낸다. 가능한 미래 치료를 위해 분리 된 지방 유래 줄기 세포를 사용하는 가장 중요한 이점 중 하나는 동결 보존의 가능성입니다. 냉동 보존 된 지방 흡인물은 6 주간의 냉동28 후에도 SVF 세포의 잠재적 공급원이며, 2 년의 냉동 보존29 후에도 생물학적 활성이 있으며, 배양30에서 성장하고 분화 할 수있는 완전한 능력을 가지고 있음이 입증되었습니다. 그러나, 해동 과정 동안, 상당한 비율의 세포가 보통 손실된다(31). 따라서 지방 흡인 제거 과정과 다음과 같은 세포 분리 방법은 최고의 세포 수율을 보장해야합니다.

이 연구는 ADSC를 수집하고 분리하는 더 빠른 방법론을 설명하여 세포 치료제의 효율성을 높이기 위해 높은 세포 수율과 생존력을 보여줍니다. 또한, 장기 SVF 동결 보존 후이 개선 된 기술의 효과가 평가되었습니다.

Protocol

본 연구는 UNIFESP 윤리위원회 (프로토콜 번호 : 0029/2015 CAAE : 40846215.0.0000.5505)의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언 (2004)에 따라 환자로부터 서면 동의를받은 후 수행되었습니다. 본 연구의 샘플은 33-50 세 (평균 연령 41.5)이고 평균 초기 체질량 지수 (BMI)가 24.54 (22.32-26.77 사이) (표 1)의 9 명의 여성 환자로 구성되어 있으며, 상파울루 연방 대학교 (UNIFESP)의 성형 외과 부서에서 임신 후 피부 과?…

Representative Results

나이, 체중, 키 및 BMI를 포함하여 연구 된 9 명의 개인의 특성은 표 1에 나와 있습니다. 초기에 제시된 세포 수율에 따라, 배양물에 접종된 세포 부피는 75cm2 배양 플라스크의 용량에 가능한 한 근접한 것으로 계산되었다. 각 경우에 시딩된 샘플 부피는 표 2에 설명되어 있습니다. 그런 다음 초기 세포 수율에 따라 각 샘플에 대한 다양한 세포 부?…

Discussion

절연 수율
세포 치료에 자주 요구되는 동결 보존 과정은 때로는 50 % 이상의 상당한 세포 손실을 초래한다는 것이 잘 알려져 있습니다.29,30,35. 따라서, 고립 된 상태에서 높은 초기 세포 수율을 얻기위한 기술적 개선이 기본이다. 지방 흡인물의 수집 방법과 세포의 분리 방법은 세포의 장기 배양 및 조작을 고려하?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

참여에 자원한 환자들과 상파울루 병원의 의료 및 간호 직원들에게 감사드립니다. 이 연구는 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)와 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)의 지원을 받았습니다.

Materials

1.8 mL cryovials Nunc Thermo Fisher Scientific 340711
150 mL polyvinyl chloride transfer bag JP FARMA 80146150059
2% Alizarin Red S Solution, pH 4.2 Sigma Aldrich A5533
Adrenaline (1 mg/mL) Hipolabor NA
Alcian Blue solution Sigma Aldrich 1,01,647
Antibiotic-Antimycotic 100x Gibco 15240062
BD FACSCalibur Flow Cytometer using BD CellQues Pro Analysis BD BioSciences NA
Calcium chloride 10% Merck 102379
Chlorhexidine gluconate 4% VIC PHARMA NA
Collagenase, Type I, powder Gibco 17018029
DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) Gibco 11966025
DPBS no calcium, no magnesium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) Gibco A1285801
DPBS with calcium (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems) Gibco A1285601
Fetal bovine serum Gibco 10500056
Formaldehyde 4% Sigma Aldrich 1,00,496
Inverted light microscope Nikon Eclipse TS100 NA
Live and Dead Cell Assay Thermofisher 01-3333-41 | 01-3333-42
Monoclonal antibody: CD105 BD BioSciences 745927
Monoclonal antibody: CD11B BD BioSciences 746004
Monoclonal antibody: CD19 BD BioSciences 745907
Monoclonal antibody: CD34 BD BioSciences 747822
Monoclonal antibody: CD45 DAKO M0701
Monoclonal antibody: CD73 BD BioSciences 746000
Monoclonal antibody: CD90 BD BioSciences 553011
Monoclonal antibody: HLA-DR BD BioSciences 340827
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
PBS (phosphate buffered saline) 1x pH 7.4 Gibco  10010023
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Gibco A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit Gibco A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Gibco A1007201
Sterile connector with one spike with needle injection site Origen Biomedical Connector, USA NA Code mark: IBS
Trypan blue solution 0.4% Sigma Aldrich 93595
Trypsin-EDTA 0.25% 1x, phenol red Gibco 25200056
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Pola-Silva, L., Xerfan Nahas, F., Nascimento, F., Santos, T. R., Malinverni, A. M., Alves, A., Ferreira, L. M., Melaragno, M. I. Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation. J. Vis. Exp. (178), e63036, doi:10.3791/63036 (2021).
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