خوارزمية تحليل الصور القائمة على المنطقة لتحديد كمية البلاعم والخلايا الليفية المشتركة
Summary
نقدم طريقة تستخدم نهجا قابلا للتعميم لتحليل الصور القائم على المنطقة لتحديد عدد الخلايا. استغل تحليل مجموعات الخلايا المختلفة ارتفاع الخلية الكبير والاختلافات الهيكلية بين أنواع الخلايا المتميزة داخل خوارزمية تكيفية.
Abstract
القياس الكمي للخلايا ضروري لمجموعة واسعة من الدراسات البيولوجية والكيميائية الحيوية. عادة ما يستخدم تحليل الصور التقليدي للخلايا إما أساليب الكشف عن التألق ، مثل تلطيخ الفلورسنت المناعي أو النقل باستخدام البروتينات الفلورية أو تقنيات الكشف عن الحافة ، والتي غالبا ما تكون عرضة للخطأ بسبب الضوضاء وغيرها من غير المثالية في خلفية الصورة.
لقد صممنا خوارزمية جديدة يمكنها حساب وتمييز البلاعم والخلايا الليفية بدقة ، وهي خلايا ذات أنماط ظاهرية مختلفة غالبا ما تتعايش أثناء تجديد الأنسجة. تم استخدام MATLAB لتنفيذ الخوارزمية ، التي ميزت أنواع الخلايا المتميزة بناء على الاختلافات في الارتفاع من الخلفية. تم تطوير خوارزمية أولية باستخدام طريقة قائمة على المنطقة لحساب الاختلافات في حجم / بنية الخلية وظروف البذر عالية الكثافة.
تم حساب عدم المثالية في هياكل الخلايا باستخدام خوارزمية ثانوية متكررة تستخدم معلمات داخلية مثل تغطية الخلية المحسوبة باستخدام البيانات التجريبية لنوع معين من الخلايا. وأخيرا، أجري تحليل لبيئات الزراعة المشتركة باستخدام خوارزمية عزل تم فيها استبعاد أنواع مختلفة من الخلايا بشكل انتقائي بناء على تقييم الاختلافات النسبية في الارتفاع داخل الصورة. تم العثور على هذا النهج لحساب الخلايا بدقة ضمن هامش خطأ 5٪ للخلايا أحادية الزراعة وضمن هامش خطأ 10٪ للخلايا المستزرعة.
Introduction
يتم تنفيذ البرنامج بشكل روتيني أثناء تقنيات تحليل الصور لضمان دقة النتائج وكفاءتها وعدم تحيزها. بالنسبة للفحوصات القائمة على الخلايا ، هناك مشكلة شائعة تتمثل في التعرف الخاطئ على الخلايا. قد تؤدي الصور ذات الإعدادات البؤرية والتباين غير المناسبة إلى طمس الخلايا، حيث يصبح من الصعب تحديد حدود الخلايا الفردية1. يمكن أن يؤدي وجود ميزات صور غريبة مثل المسام أو الفقاعات أو غيرها من الأشياء غير المرغوب فيها إلى إعاقة إجراءات العد عن طريق إبطاء عملية العد ويؤدي إلى تحديد الهوية بشكل خاطئ. علاوة على ذلك ، يمكن أن يكون عد الخلايا مرهقا ، ويمكن أن يكون عد مئات النسخ المتماثلة مستهلكا للوقت للغاية. علاوة على ذلك ، يوجد تحيز ذاتي متأصل أثناء العد اليدوي ، وبالتالي فإن اتخاذ القرارات المتعلقة بتحديد الخلايا غالبا ما يكون غير دقيق2. توفر البرامج الآلية إمكانات مثيرة لتجاوز كل هذه القضايا من خلال التمييز السريع والدقيق بين الخلايا والأجسام الدخيلة ، بما في ذلك الأشياء التي تتجاوز القدرة البشرية على الكشف الدقيق ، استنادا إلى معايير تحديد الهوية المحددة جيدا التي تقلل من تأثير تحيز المحققين. تتضمن التقنيات الشائعة لتحديد الخلايا باستخدام البرامج الآلية طريقتين رئيسيتين: التجزئة والعتبة3. هنا ، نعرض بروتوكولا قابلا للتعميم قائما على المنطقة يتيح عد الخلايا بسرعة ودقة وغير مكلفة ضمن إطار برمجي يمكن الوصول إليه على نطاق واسع.
تسعى تقنيات التجزئة ، مثل اكتشاف الحافة ، إلى عزل الخلايا الفردية من خلال استخدام اختلافات الكثافة داخل الصورة. غالبا ما تتكون تغيرات الشدة التي تميز الخلية عن بقية الصورة من تغيرات حادة في السطوع4. يتضمن اكتشاف الحافة خطوة تصفية تنظيمية ، تليها خطوة تمايز يتم فيها اكتشاف تغييرات الكثافة. تحدد عملية التمايز الحواف والخطوط داخل صورة التغييرات عالية الكثافة، وترتبط هذه الحواف والخطوط بوجود الخلية. على الرغم من أنه يمكن تشغيل الصور ذات الضوضاء من خلال خوارزميات إزالة الضوضاء4 ، إلا أن تقنيات اكتشاف الحافة تستخدم بشكل مثالي لتحليل الصور ذات الضوضاء المنخفضة في الخلفية. تعمل العملية على النحو الأمثل عندما تكون حدود الخلايا قابلة للتمييز بوضوح وسهولة ولا تعوقها ملامح السطوع التي لا علاقة لها بوجود الخلية أو ضبابية الخلية أو الكائنات الدخيلة أو هياكل الخلايا الداخلية المحددة 1,2. إذا كانت الصورة صاخبة بشكل خاص ، فقد يتم تمييز الخلايا بشكل أكبر من خلال تلطيخ الفلورسنت أو نقله مع بروتينات الفلورسنت 2,5. على الرغم من أن هذا يحسن بشكل كبير من دقة تقنيات التجزئة ، إلا أنه يتطلب تكاليف إضافية واستثمارات زمنية إضافية لإعداد مزارع الخلايا للتصوير.
تتضمن تقنيات العتبة تقسيم الصورة إلى فئتين: المقدمة والخلفية ، مع تعيين الخلايا إلى المقدمة3. تستخدم هذه التقنيات تغييرات اللون / التباين لتحديد الارتفاع الظاهري للكائن. يمكن التعرف بسهولة على الكائنات التي تكون “أطول” بشكل روتيني من الخلفية كخلايا. يعمل تحويل مستجمعات المياه بهذه الطريقة عن طريق ربط الأسطح بوحدات البكسل الفاتحة كمقدمة وتلك التي تحتوي على وحدات بكسل داكنة كخلفية 6,7. من خلال التحديد القائم على الارتفاع ، يمكن لتقنيات العتبة التمييز بشكل روتيني بين الضوضاء والأشياء المطلوبة ، شريطة أن تكون موجودة داخل نفس المستوى البؤري. عند إقرانه بقياس كمي قائم على المنطقة ، يمكن لتحويل مستجمعات المياه تحديد مجموعات الكائنات بدقة في البيئات التي تكون فيها تقنيات التجزئة النموذجية مثل اكتشاف الحافة غير دقيقة.
عادة ما تقترن تحويلات مستجمعات المياه بتقنيات التجزئة لإعداد الصور لتحليل أنظف ، مما يؤدي إلى دقة أعلى في عد الخلايا. ولهذه العملية، يستخدم تحويل مستجمعات المياه لتسليط الضوء على المناطق المحتملة ذات الأهمية قبل التقسيم. يوفر تحويل مستجمعات المياه فوائد فريدة من نوعها من خلال تحديد الخلايا في مقدمة الصور ، والتي يمكن أن تحسن دقة تحليل التجزئة عن طريق إزالة الإيجابيات الخاطئة المحتملة للخلايا ، مثل بقع الخلفية غير المستوية. ومع ذلك ، يمكن أن تنشأ صعوبات عند محاولة تكييف الصور القائمة على الخلايا مع تحويل مستجمعات المياه. يمكن أن تعاني الصور ذات الكثافة العالية للخلايا من تجزئة ناقصة ، حيث يتم تحديد مجاميع الخلايا كمجموعة مفردة بدلا من كونها مكونات فردية. يمكن أن يؤدي وجود ضوضاء أو تغيرات حادة في الكثافة أيضا إلى الإفراط في التجزئة ، حيث تفرط الخوارزمية في عزل الخلايا ، مما يؤدي إلى تعداد مفرط وغير دقيق للخلايا8.
في هذا ، نفصل طريقة لتقليل العيوب الأولية لتحويل مستجمعات المياه من خلال دمج مكونات تحليل العتبة ضمن خوارزمية تحديد كمي قائمة على المنطقة ، كما هو موضح في الشكل 1. ومن الجدير بالذكر أن هذه الخوارزمية قد تم تنفيذها باستخدام برامج مفتوحة المصدر و / أو متاحة على نطاق واسع ، وكان تطبيق إطار عد الخلايا هذا ممكنا بدون كواشف باهظة الثمن أو تقنيات تحضير الخلايا المعقدة. تم استخدام البلاعم RAW264.7 لإظهار الطريقة بسبب دورها الحاسم في تنظيم صيانة النسيج الضام وعمليات التئام الجروح9. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل الخلايا الليفية NIH / 3T3 بسبب دورها الرئيسي في صيانة الأنسجة وإصلاحها. غالبا ما تتعايش الخلايا الليفية مع البلاعم وتدعمها، مما يولد الحاجة إلى التمييز بين هذه الأنواع من الخلايا المتميزة ظاهريا في دراسات الزراعة المشتركة.
يمكن تحديد عدد الخلايا من الصور ذات الكثافة الخلوية العالية القابلة للحياة (VCD) بشكل موثوق وفعال عن طريق حساب المساحة التي تغطيها الخلايا ، ومتوسط المساحة التي تشغلها خلية مفردة. كما مكن استخدام العتبة بدلا من التجزئة لتحديد الخلايا من إجراء تحليلات أكثر تعقيدا ، مثل التجارب التي تم فيها تحليل أنواع الخلايا المختلفة في المزارع المشتركة في وقت واحد. تم العثور على الخلايا الليفية NIH / 3T3 ، والتي غالبا ما يتم العثور عليها لتوطينها مع البلاعم RAW264.7 داخل موقع التئام الجروح ، تنمو في مستوى بؤري كان مختلفا عن المستوى البؤري للبلاعم10. وبناء على ذلك، تم تشغيل خوارزميات عتبة متعددة لتحديد الخلفية والمقدمة اعتمادا على نوع الخلية التي يتم تحليلها، مما يتيح العد الدقيق لنوعين مختلفين من الخلايا داخل نفس الصورة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد صممنا إجراء عاما قائما على المنطقة يقوم بحساب الخلايا بدقة وكفاءة على أساس ارتفاع الخلية ، مما يسمح بقياس كمية الخلايا الخالية من البقع حتى في أنظمة الزراعة المشتركة. وشملت الخطوات الحاسمة لهذا الإجراء تنفيذ نظام كثافة نسبية يمكن من خلاله تمييز الخلايا. وقد خدم استخدام تحليل الارتفاع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AR067247) وجزئيا من قبل برنامج ديلاوير INBRE ، بدعم من منحة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة – NIGMS (P20 GM103446) من المعاهد الوطنية للصحة وولاية ديلاوير. ولا تعكس محتويات المخطوطة بالضرورة آراء وكالات التمويل.
Materials
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL – 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB – 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. – 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T. On edge detection. MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022)
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022)
- Atherton, T., Kerbyson, D. Size invariant circle detection. Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
