대식세포-섬유아세포 공동배양물의 정량화를 위한 영역 기반 이미지 분석 알고리즘
Summary
우리는 세포 수를 식별하기 위해 일반화 가능한 영역 기반 이미지 분석 접근법을 활용하는 방법을 제시합니다. 상이한 세포 집단의 분석은 적응형 알고리즘 내에서 별개의 세포 유형 사이의 유의한 세포 높이 및 구조 차이를 이용하였다.
Abstract
세포의 정량화는 광범위한 생물학적 및 생화학적 연구에 필요하다. 세포의 종래의 이미지 분석은 전형적으로 면역형광 염색 또는 형광 단백질로 형질감염 또는 에지 검출 기술과 같은 형광 검출 접근법을 이용하는데, 이는 종종 이미지 배경에서 노이즈 및 다른 비이상성으로 인해 오류가 발생하기 쉽다.
우리는 대식세포와 섬유아세포, 조직 재생 중에 종종 공국소화되는 다양한 표현형의 세포를 정확하게 계산하고 구별할 수 있는 새로운 알고리즘을 설계했습니다. MATLAB은 배경과의 높이 차이에 따라 별개의 세포 유형을 차별화하는 알고리즘을 구현하는 데 사용되었습니다. 기본 알고리즘은 세포 크기 / 구조 및 고밀도 시딩 조건의 변화를 설명하기 위해 영역 기반 방법을 사용하여 개발되었습니다.
세포 구조에서 비이상성은 주어진 세포 유형에 대한 실험 데이터를 사용하여 계산된 세포 커버리지와 같은 내부 파라미터를 활용하는 이차적이고 반복적인 알고리즘으로 설명되었다. 마지막으로, 영상 내의 상대적 높이 차이의 평가에 기초하여 다양한 세포 유형이 선택적으로 배제되는 격리 알고리즘을 사용하여 공동 배양 환경의 분석이 수행되었다. 이 접근법은 단배양된 세포에 대해 5% 오차 한계 내에서 그리고 공동 배양된 세포에 대해 10% 오차 한계 내에서 세포를 정확하게 계수하는 것으로 밝혀졌다.
Introduction
소프트웨어는 이미지 분석 기술 중에 일상적으로 구현되어 결과가 정확하고 효율적이며 편향되지 않도록합니다. 세포 기반 분석의 경우, 일반적인 문제는 세포의 오인입니다. 부적절한 초점 및 대비 설정이 있는 이미지는 셀 블러링으로 이어질 수 있으며, 여기서 개별 셀의 경계는1을 식별하기 어려워집니다. 기공, 거품 또는 기타 바람직하지 않은 물체와 같은 외래 이미지 기능이 있으면 계산 프로세스가 느려지고 잘못 식별되어 계산 절차가 방해받을 수 있습니다. 또한 셀 카운팅은 번거로울 수 있으며 수백 번의 반복실험을 계산하는 데 매우 시간이 많이 걸릴 수 있습니다. 더욱이, 수동 카운팅 동안 내재된 주관적 편향이 존재하며, 따라서 세포 식별에 관한 의사 결정은 종종 부정확하다2. 자동화 된 소프트웨어는 조사자 편향의 영향을 줄이는 잘 정의 된 식별 기준에 따라 정확한 탐지를위한 인간 능력을 훨씬 뛰어 넘는 물체를 포함하여 세포를 외부 물체와 신속하고 정확하게 구별함으로써 이러한 모든 문제를 우회 할 수있는 흥미로운 잠재력을 제공합니다. 자동화 된 소프트웨어를 사용하여 세포를 식별하는 일반적인 기술은 세분화 및 임계 값3의 두 가지 주요 방법을 포함합니다. 여기에서는 널리 접근 가능한 소프트웨어 프레임 워크 내에서 빠르고 정확하며 저렴한 셀 카운팅을 가능하게하는 일반화 가능한 영역 기반 프로토콜을 시연합니다.
에지 검출과 같은 세분화 기술은 이미지 내에서 강도 차이를 활용하여 개별 세포를 분리하려고 합니다. 셀을 이미지의 나머지 부분과 구별하는 강도 변화는 대부분 밝기의 급격한 변화로 구성됩니다4. 에지 감지에는 정규화 필터링 단계와 강도 변화가 감지되는 차별화 단계가 포함됩니다. 분화 과정은 고강도 변화의 이미지 내에서 가장자리와 윤곽선을 식별하며, 이러한 가장자리와 윤곽선은 세포 존재와 상관 관계가 있습니다. 노이즈가 있는 이미지는 디노이징 알고리즘(denoising algorithm)4을 통해 실행될 수 있지만, 엣지 검출 기술은 배경 노이즈가 낮은 이미지를 분석하는 데 이상적으로 사용된다. 이 과정은 세포 경계가 명확하고 쉽게 구별 될 수 있고 세포 존재, 셀 블러, 외래 물체 또는 정의 된 내부 세포 구조 1,2와 관련이없는 밝기 윤곽선에 의해 방해받지 않을 때 최적으로 기능합니다. 이미지가 특히 시끄러운 경우, 세포는 형광 염색 또는 형광 단백질 2,5로의 형질감염을 통해 추가로 구별될 수 있다. 이것은 세분화 기술의 정확성을 크게 향상 시키지만 이미징을 위해 세포 배양을 준비하기 위해 추가 비용과 추가 시간 투자가 필요합니다.
임계 값 지정 기술은 이미지를 전경과 배경의 두 가지 범주로 나누고 셀은 전경에 할당됩니다3. 이러한 기술은 색상/대비 변경을 활용하여 객체의 겉보기 높이를 정의합니다. 배경보다 일상적으로 ‘키가 큰’객체는 세포로 쉽게 식별 할 수 있습니다. 유역 변환은 표면을 밝은 픽셀을 전경으로 연결하고 어두운 픽셀을 배경으로 하는 표면을 6,7로 연결하여 이러한 방식으로 작동합니다. 높이 기반 식별을 통해, 임계 기술은 동일한 초점 평면 내에 존재하는 경우 원하는 물체와 노이즈를 일상적으로 구별 할 수 있습니다. 영역 기반 정량화와 함께 사용할 경우 유역 변환은 에지 감지와 같은 일반적인 세분화 기술이 부정확할 수 있는 환경에서 개체 그룹을 정확하게 식별할 수 있습니다.
유역 변환은 일반적으로 세분화 기술과 결합하여 더 깨끗한 분석을 위해 이미지를 준비하므로 셀 카운팅의 정확도가 높아집니다. 이 과정에서 유역 변환은 세분화 전에 잠재적 인 관심 영역을 강조하는 데 사용됩니다. 유역 변환은 이미지의 전경에서 세포를 식별함으로써 독특한 이점을 제공하며, 이는 배경의 고르지 않은 패치와 같은 세포에 대한 잠재적 인 오탐을 제거하여 세분화 분석의 정확성을 향상시킬 수 있습니다. 그러나 셀 기반 이미지를 유역 변환에 적용하려고 할 때 어려움이 발생할 수 있습니다. 높은 세포 밀도를 가진 이미지는 세포의 응집체가 개별 구성 요소가 아닌 단일 그룹으로 식별되는 과소 세분화로 어려움을 겪을 수 있습니다. 잡음 또는 급격한 강도 변화의 존재는 또한 알고리즘이 세포를 과도하게 분리하여 과도하고 부정확한 셀 카운트를 초래하는 과분화를 초래할 수 있다8.
여기서는, 도 1에 도시된 바와 같이, 영역 기반 정량화 알고리즘 내에 임계 분석의 성분을 통합함으로써 유역 변환의 주요 단점을 최소화하는 방법을 상세히 설명한다. 특히, 이 알고리즘은 오픈 소스 및/또는 널리 이용가능한 소프트웨어로 구현되었으며, 이 셀 카운팅 프레임워크의 적용은 값비싼 시약이나 복잡한 세포 준비 기술 없이도 가능했다. RAW264.7 대식세포는 결합 조직 유지 및 상처 치유 과정을 조절하는데 있어서 그들의 중요한 역할로 인한 방법을 입증하기 위해 사용되었다9. 또한, NIH/3T3 섬유아세포는 조직 유지 및 복구에 중요한 역할을 하기 때문에 분석되었습니다. 섬유아세포는 종종 대식세포와 공존하고 지지하며, 공배양 연구에서 이러한 표현형적으로 구별되는 세포 유형을 구별할 필요성을 발생시킨다.
높은 생존 가능한 셀 밀도 (VCD)를 갖는 이미지로부터의 셀 카운트는 셀에 의해 덮인 면적과 단수 셀에 의해 점유된 평균 면적을 계산함으로써 안정적이고 효율적으로 정량화될 수 있었다. 세포 식별을 위한 세분화와 반대로 역치의 사용은 또한 공동 배양물에서 상이한 세포 유형이 동시에 분석되는 실험과 같은 더 복잡한 분석을 가능하게 했다. 상처 치유 부위 내에서 RAW264.7 대식세포와 공국소화하는 것으로 종종 발견되는 NIH/3T3 섬유아세포는 대식세포10의 초점면과 구별되는 초점면에서 성장하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 분석되는 셀 유형에 따라 배경과 전경을 정의하기 위해 여러 임계값 알고리즘이 실행되어 동일한 이미지 내에서 두 개의 서로 다른 셀 유형을 정확하게 계산할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 세포 높이를 기준으로 세포를 정확하고 효율적으로 계산하는 일반적인 영역 기반 절차를 설계하여 공동 배양 시스템에서도 세포의 얼룩없는 정량을 가능하게했습니다. 이 절차의 중요한 단계에는 세포가 분화 될 수있는 상대적 강도 시스템의 구현이 포함되었습니다. 상대 높이 분석의 사용은 두 가지 목적을 달성했습니다 : 상대 매개 변수가 주어진 셀 유형 및 매개 변수에 대해 일정하고…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 부분적으로 국립 보건원 (R01 AR067247)과 델라웨어 INBRE 프로그램에 의해 부분적으로 자금을 지원했으며, 국립 보건원 (National Institutes of Health)과 델라웨어 주 (State of Delaware)의 국립 일반 의료 과학 연구소 (P20 GM103446)의 보조금으로 지원되었습니다. 원고의 내용이 반드시 자금 조달 기관의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.
Materials
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL – 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB – 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
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