Makrofaj-fibroblast Kokültürlerinin Nicelleştirilmesi için Alan Tabanlı Görüntü Analiz Algoritması
Summary
Hücre sayımlarını tanımlamak için genelleştirilebilir alan tabanlı görüntü analizi yaklaşımını kullanan bir yöntem sunuyoruz. Farklı hücre popülasyonlarının analizi, uyarlanabilir bir algoritma içinde farklı hücre tipleri arasındaki önemli hücre yüksekliği ve yapı farklılıklarından yararlandı.
Abstract
Hücrelerin nicelleştirilmesi, çok çeşitli biyolojik ve biyokimyasal çalışmalar için gereklidir. Hücrelerin geleneksel görüntü analizi, tipik olarak, immünofloresan boyama veya floresan proteinlerle transfeksiyon gibi floresan algılama yaklaşımlarını veya görüntü arka planındaki gürültü ve diğer ideal olmayan şeyler nedeniyle genellikle hataya eğilimli olan kenar algılama tekniklerini kullanır.
Makrofajları ve fibroblastları, doku rejenerasyonu sırasında sıklıkla kolokalize olan farklı fenotiplerin hücrelerini doğru bir şekilde sayabilen ve ayırt edebilen yeni bir algoritma tasarladık. MATLAB, arka plandan yükseklik farklılıklarına dayanarak farklı hücre tiplerini farklılaştıran algoritmayı uygulamak için kullanıldı. Hücre boyutu/yapısı ve yüksek yoğunluklu tohumlama koşullarındaki değişimleri hesaba katmak için alan tabanlı bir yöntem kullanılarak birincil bir algoritma geliştirilmiştir.
Hücre yapılarındaki ideal olmayanlar, belirli bir hücre tipi için deneysel veriler kullanılarak hesaplanan hücre kapsamı gibi dahili parametreleri kullanan ikincil, yinelemeli bir algoritma ile açıklandı. Son olarak, görüntü içindeki göreceli yükseklik farklılıklarının değerlendirilmesine dayanarak çeşitli hücre tiplerinin seçici olarak dışlandığı bir izolasyon algoritması kullanılarak kokültür ortamlarının bir analizi gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşımın, monokültürlü hücreler için% 5’lik bir hata marjı içindeki hücreleri ve kokültürlü hücreler için% 10’luk bir hata marjı içindeki hücreleri doğru bir şekilde saydığı bulunmuştur.
Introduction
Yazılım, sonuçların doğru, verimli ve tarafsız olmasını sağlamak için görüntü analizi teknikleri sırasında rutin olarak uygulanır. Hücre bazlı tahliller için yaygın bir sorun, hücrelerin yanlış tanımlanmasıdır. Uygun olmayan odak ve kontrast ayarlarına sahip görüntüler, tek tek hücrelerin sınırlarının tanımlanmasının zorlaştığı hücre bulanıklığına neden olabilir1. Gözenekler, kabarcıklar veya diğer istenmeyen nesneler gibi yabancı görüntü özelliklerinin varlığı, sayma işlemini yavaşlatarak ve yanlış tanımlamaya yol açarak sayma prosedürlerini engelleyebilir. Ayrıca, hücre sayımı zahmetli olabilir ve yüzlerce kopyayı saymak son derece zaman alıcı olabilir. Dahası, manuel sayım sırasında doğal bir öznel önyargı vardır ve bu nedenle hücre tanımlaması ile ilgili karar verme genellikle yanlıştır2. Otomatik yazılım, araştırmacı önyargısının etkisini azaltan iyi tanımlanmış tanımlama kriterlerine dayanarak, hücreleri hassas algılama için insan kapasitesinin çok ötesindeki nesneler de dahil olmak üzere yabancı nesnelerden hızlı ve hassas bir şekilde ayırt ederek tüm bu sorunları atlamak için heyecan verici bir potansiyel sunar. Otomatik yazılım kullanarak hücreleri tanımlamak için yaygın teknikler iki ana yöntemi içerir: segmentasyon ve eşik3. Burada, yaygın olarak erişilebilir bir yazılım çerçevesinde hızlı, doğru ve ucuz hücre sayımını sağlayan genelleştirilebilir alan tabanlı bir protokol sunuyoruz.
Kenar algılama gibi segmentasyon teknikleri, bir görüntüdeki yoğunluk farklılıklarını kullanarak tek tek hücreleri izole etmeyi amaçlar. Bir hücreyi görüntünün geri kalanından ayıran yoğunluk değişiklikleri çoğunlukla parlaklıktaki keskin değişikliklerden oluşur4. Kenar algılama, düzenli bir filtreleme adımını ve ardından yoğunluk değişikliklerinin algılandığı bir farklılaştırma adımını içerir. Farklılaşma süreci, yüksek yoğunluklu değişikliklerin görüntüsündeki kenarları ve konturları tanımlar ve bu kenarlar ve konturlar hücre varlığı ile ilişkilidir. Gürültülü görüntüler gürültü giderme algoritmaları4 aracılığıyla çalıştırılabilse de, kenar algılama teknikleri düşük arka plan gürültüsüne sahip görüntüleri analiz etmek için idealdir. İşlem, hücre sınırları açıkça ve kolayca ayırt edilebildiğinde ve hücre varlığı, hücre bulanıklığı, yabancı nesneler veya tanımlanmış iç hücre yapıları ile ilgisi olmayan parlaklık konturları tarafından engellenmediğinde en iyi şekilde çalışır 1,2. Bir görüntü özellikle gürültülüyse, hücreler floresan boyama veya floresan proteinleri ile transfeksiyon yoluyla daha da ayırt edilebilir 2,5. Bu, segmentasyon tekniklerinin doğruluğunu önemli ölçüde artırsa da, hücre kültürlerini görüntülemeye hazırlamak için ek maliyetler ve ek zaman yatırımları gerektirir.
Eşik teknikleri, bir görüntünün iki kategoriye ayrılmasını içerir: ön plan ve arka plan, ön plana atanmış hücreler3. Bu teknikler, bir nesnenin görünür yüksekliğini tanımlamak için renk / kontrast değişikliklerini kullanır; arka plandan rutin olarak ‘daha uzun’ olan nesneler kolayca hücre olarak tanımlanabilir. Havza-dönüşüm, yüzeyleri ön plan olarak açık piksellerle ve arka plan 6,7 olarak koyu pikselli yüzeyleri ilişkilendirerek bu şekilde çalışır. Yüksekliğe dayalı tanımlama yoluyla, eşik teknikleri, aynı odak düzleminde bulunmaları koşuluyla, gürültüyü istenen nesnelerden rutin olarak ayırt edebilir. Alan tabanlı bir niceleme ile eşleştirildiğinde, bir havza dönüşümü, kenar algılama gibi tipik segmentasyon tekniklerinin yanlış olacağı ortamlardaki nesne gruplarını doğru bir şekilde tanımlayabilir.
Havza dönüşümleri, görüntüleri daha temiz bir analiz için hazırlamak için genellikle segmentasyon teknikleriyle birleştirilir ve hücre sayımının daha yüksek doğruluğu ile sonuçlanır. Bu süreç için, havza dönüşümü, segmentasyondan önce potansiyel ilgi alanlarını vurgulamak için kullanılır. Bir havza dönüşümü, görüntülerin ön planındaki hücreleri tanımlayarak benzersiz faydalar sağlar; bu, düzensiz arka plan yamaları gibi hücreler için potansiyel yanlış pozitifleri kaldırarak segmentasyon analizinin doğruluğunu artırabilir. Bununla birlikte, hücre tabanlı görüntüleri bir havza dönüşümüne uyarlamaya çalışırken zorluklar ortaya çıkabilir. Yüksek hücre yoğunluğuna sahip görüntüler, hücre agregalarının tek tek bileşenler yerine tekil bir grup olarak tanımlandığı alt segmentasyonla boğuşabilir. Gürültü veya keskin yoğunluk değişikliklerinin varlığı, algoritmanın hücreleri aşırı izole ettiği ve aşırı ve yanlış hücre sayımlarına neden olan aşırı segmentasyona da neden olabilir8.
Burada, Şekil 1’de gösterildiği gibi, bir eşik analizinin bileşenlerini alan tabanlı bir niceleme algoritmasına dahil ederek havza dönüşümünün birincil dezavantajlarını en aza indirgemek için bir yöntem detaylandırıyoruz. Özellikle, bu algoritma açık kaynaklı ve / veya yaygın olarak bulunan yazılımlarla uygulandı ve bu hücre sayma çerçevesinin uygulanması, pahalı reaktifler veya karmaşık hücre hazırlama teknikleri olmadan mümkün oldu. RAW264.7 makrofajları, bağ dokusu bakımı ve yara iyileşme süreçlerinin düzenlenmesindeki kritik rolleri nedeniyle yöntemi göstermek için kullanıldı9. Ek olarak, NIH / 3T3 fibroblastları doku bakımı ve onarımındaki kilit rolleri nedeniyle analiz edildi. Fibroblast hücreleri sıklıkla makrofajlarla birlikte bulunur ve onları destekler, bu da kokültür çalışmalarında bu fenotipik olarak farklı hücre tiplerini ayırt etme ihtiyacını doğurur.
Yüksek canlı hücre yoğunluğuna (VCD) sahip görüntülerden elde edilen hücre sayımları, hücrelerin kapladığı alanı ve tekil bir hücrenin kapladığı ortalama alanı hesaplayarak güvenilir ve verimli bir şekilde ölçülebilir. Hücre tanımlaması için segmentasyonun aksine eşik değerlemenin kullanılması, kokültürlerdeki farklı hücre tiplerinin eşzamanlı olarak analiz edildiği deneyler gibi daha karmaşık analizlere de olanak sağlamıştır. Genellikle bir yara iyileşme bölgesi içinde RAW264.7 makrofajları ile kolokalize olduğu tespit edilen NIH / 3T3 fibroblastlarının,makrofajların fokal düzleminden farklı bir odak düzleminde büyüdüğü bulunmuştur. Buna göre, analiz edilen hücre tipine bağlı olarak arka planı ve ön planı tanımlamak için çoklu eşik algoritmaları çalıştırıldı ve aynı görüntü içindeki iki farklı hücre tipinin doğru sayılmasını sağladı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücreleri hücre yüksekliğine göre doğru ve verimli bir şekilde sayan ve kokültür sistemlerinde bile hücrelerin lekesiz kantitasyonuna izin veren genel bir alan tabanlı prosedür tasarladık. Bu prosedür için kritik adımlar, hücrelerin farklılaştırılabileceği göreceli bir yoğunluk sisteminin uygulanmasını içeriyordu. Göreceli yükseklik analizinin kullanılması iki amaca hizmet etti: verilen hücre tipi ve parametresi için göreceli parametreler sabit olduğundan ve her görüntü için mutlak …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AR067247) ve kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Delaware Eyaleti’nden Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü-NIGMS (P20 GM103446) tarafından desteklenen Delaware INBRE programı tarafından finanse edilmiştir. Makalenin içeriği, finansman kuruluşlarının görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.
Materials
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL – 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB – 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
- Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
- Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. An extended type cell detection and counting method based on FCN. Proc. – 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).
- Choudhry, P. High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection. PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).
- Torre, V., Poggio, T. On edge detection. MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).
- Fuller, M. E., et al. Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments. Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).
- Meyer, F. Topographic distance and watershed lines. Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html (2022)
- Bala, A. An improved watershed image segmentation technique using MATLAB. International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).
- Glaros, T., Larsen, M., Li, L. Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).
- Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis. Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).
- Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).
- Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks Available from: https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html (2022)
- Atherton, T., Kerbyson, D. Size invariant circle detection. Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).
- Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform. International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell. Micron. 133, 102863 (2020).
- Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images. Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).
- Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).
- Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts. Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).
- Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes. Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).
- Wang, Z., Li, H. Generalizing cell segmentation and quantification. BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).
- Zou, K. H., et al. Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index. Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).
