Gebiedsgebaseerd beeldanalysealgoritme voor kwantificering van macrofaag-fibroblastcoculturen

Summary

We presenteren een methode, die gebruik maakt van een generaliseerbare gebiedsgebaseerde beeldanalysebenadering om celtellingen te identificeren. Analyse van verschillende celpopulaties maakte gebruik van de significante celhoogte en structuurverschillen tussen verschillende celtypen binnen een adaptief algoritme.

Abstract

Kwantificering van cellen is noodzakelijk voor een breed scala aan biologische en biochemische studies. Conventionele beeldanalyse van cellen maakt meestal gebruik van fluorescentiedetectiebenaderingen, zoals immunofluorescente kleuring of transfectie met fluorescerende eiwitten of randdetectietechnieken, die vaak foutgevoelig zijn vanwege ruis en andere niet-idealiteiten in de beeldachtergrond.

We ontwierpen een nieuw algoritme dat macrofagen en fibroblasten nauwkeurig kon tellen en onderscheiden, cellen van verschillende fenotypen die vaak colocaliseren tijdens weefselregeneratie. MATLAB werd gebruikt om het algoritme te implementeren, dat verschillende celtypen onderscheidde op basis van hoogteverschillen van de achtergrond. Een primair algoritme werd ontwikkeld met behulp van een gebiedsgebaseerde methode om rekening te houden met variaties in celgrootte / structuur en zaaiomstandigheden met hoge dichtheid.

Niet-idealiteiten in celstructuren werden verantwoord met een secundair, iteratief algoritme met behulp van interne parameters zoals celdekking berekend met behulp van experimentele gegevens voor een bepaald celtype. Ten slotte werd een analyse van cocultuuromgevingen uitgevoerd met behulp van een isolatiealgoritme waarbij verschillende celtypen selectief werden uitgesloten op basis van de evaluatie van relatieve hoogteverschillen binnen het beeld. Deze aanpak bleek nauwkeurig cellen te tellen binnen een foutmarge van 5% voor monoculturele cellen en binnen een foutmarge van 10% voor gecocultureerde cellen.

Introduction

Software wordt routinematig geïmplementeerd tijdens beeldanalysetechnieken om ervoor te zorgen dat de resultaten nauwkeurig, efficiënt en onbevooroordeeld zijn. Voor celgebaseerde assays is een veel voorkomend probleem de verkeerde identificatie van cellen. Beelden met onjuiste focus- en contrastinstellingen kunnen leiden tot celvervaging, waarbij de grens van individuele cellen moeilijk te identificeren is¹. De aanwezigheid van externe beeldkenmerken zoals poriën, bubbels of andere ongewenste objecten kan de telprocedures belemmeren door het telproces te vertragen en tot verkeerde identificatie te leiden. Bovendien kan het tellen van cellen belastend zijn en kan het tellen van honderden replicaties extreem tijdrovend zijn. Bovendien bestaat er een inherente subjectieve bias tijdens handmatig tellen, en daarom is de besluitvorming met betrekking tot celidentificatie vaak onnauwkeurig². Geautomatiseerde software biedt een opwindend potentieel om al deze problemen te omzeilen door cellen snel en nauwkeurig te onderscheiden van externe objecten, inclusief objecten die ver buiten de menselijke capaciteit liggen voor nauwkeurige detectie, op basis van goed gedefinieerde identificatiecriteria die de invloed van onderzoeksbias verminderen. Veelgebruikte technieken om cellen te identificeren met behulp van geautomatiseerde software omvatten twee hoofdmethoden: segmentatie en^{drempeling 3}. Hierin demonstreren we een generaliseerbaar gebiedsgebaseerd protocol dat snelle, nauwkeurige en goedkope celtelling mogelijk maakt binnen een breed toegankelijk softwareframework.

Segmentatietechnieken, zoals randdetectie, proberen individuele cellen te isoleren door gebruik te maken van intensiteitsverschillen binnen een afbeelding. Intensiteitsveranderingen die een cel onderscheiden van de rest van de afbeelding bestaan meestal uit scherpe veranderingen in helderheid⁴. Randdetectie omvat een regulariserende filterstap, gevolgd door een differentiatiestap waarin intensiteitsveranderingen worden gedetecteerd. Het differentiatieproces identificeert randen en contouren binnen het beeld van veranderingen met hoge intensiteit, en deze randen en contouren zijn gecorreleerd met celaanwezigheid. Hoewel beelden met ruis kunnen worden uitgevoerd via^{denoising-algoritmen 4}, worden randdetectietechnieken ideaal gebruikt voor het analyseren van afbeeldingen met weinig achtergrondruis. Het proces functioneert optimaal wanneer celgrenzen duidelijk en gemakkelijk te onderscheiden zijn en niet worden belemmerd door helderheidscontouren die geen verband houden met celaanwezigheid, celonscherpte, vreemde objecten of gedefinieerde interne celstructuren ^1,2. Als een beeld bijzonder luidruchtig is, kunnen cellen verder worden onderscheiden door fluorescerende kleuring of transfectie met fluorescerende eiwitten ^2,5. Hoewel dit de nauwkeurigheid van segmentatietechnieken aanzienlijk verbetert, vereist het extra kosten en extra tijdsinvesteringen om celculturen voor te bereiden op beeldvorming.

Drempeltechnieken omvatten de verdeling van een afbeelding in twee categorieën: de voorgrond en de achtergrond, met cellen toegewezen aan de voorgrond³. Deze technieken maken gebruik van kleur/contrastveranderingen om de schijnbare hoogte van een object te definiëren; objecten die routinematig ‘groter’ zijn dan de achtergrond kunnen gemakkelijk als cellen worden geïdentificeerd. De waterscheiding-transformatie functioneert op deze manier door oppervlakken te associëren met lichte pixels als voorgrond en die met donkere pixels als achtergrond ^6,7. Door middel van op hoogte gebaseerde identificatie kunnen drempeltechnieken routinematig ruis van gewenste objecten onderscheiden, op voorwaarde dat ze binnen hetzelfde brandpuntsvlak bestaan. In combinatie met een gebiedsgebaseerde kwantificering kan een stroomgebiedtransformatie nauwkeurig groepen objecten identificeren in omgevingen waar typische segmentatietechnieken zoals randdetectie onnauwkeurig zouden zijn.

Stroomgebiedtransformaties worden vaak gekoppeld aan segmentatietechnieken om beelden voor te bereiden voor een schonere analyse, wat resulteert in een hogere nauwkeurigheid van het tellen van cellen. Voor dit proces wordt de waterscheiding-transformatie gebruikt om potentiële interessante regio’s te markeren voorafgaand aan segmentatie. Een waterscheidingstransformatie biedt unieke voordelen door cellen op de voorgrond van afbeeldingen te identificeren, wat de nauwkeurigheid van segmentatieanalyse kan verbeteren door potentiële valse positieven voor cellen te verwijderen, zoals ongelijke achtergrondstukken. Er kunnen zich echter problemen voordoen bij het aanpassen van celgebaseerde beelden aan een waterscheidingstransformatie. Beelden met een hoge celdichtheid kunnen worden geplaagd door ondersegmentatie, waarbij aggregaten van cellen worden geïdentificeerd als een enkelvoudige groep in plaats van als individuele componenten. De aanwezigheid van ruis of scherpe intensiteitsveranderingen kan ook leiden tot oversegmentatie, waarbij het algoritme cellen overisoleren, wat resulteert in overmatige en onnauwkeurige celtellingen⁸.

Hierin beschrijven we een methode om de primaire nadelen van de waterscheidingstransformatie te minimaliseren door componenten van een drempelanalyse op te nemen in een gebiedsgebaseerd kwantificeringsalgoritme, zoals weergegeven in figuur 1. Met name werd dit algoritme geïmplementeerd met open-source en / of algemeen beschikbare software, en toepassing van dit raamwerk voor het tellen van cellen was mogelijk zonder dure reagentia of complexe celvoorbereidingstechnieken. RAW264.7 macrofagen werden gebruikt om de methode te demonstreren vanwege hun cruciale rol bij het reguleren van bindweefselonderhoud en wondgenezingsprocessen⁹. Bovendien werden NIH / 3T3 fibroblasten geanalyseerd vanwege hun sleutelrol in weefselonderhoud en -reparatie. Fibroblastcellen bestaan vaak naast en ondersteunen macrofagen, waardoor de noodzaak ontstaat om deze fenotypisch verschillende celtypen te onderscheiden in cocultuurstudies.

Celtellingen van afbeeldingen met een hoge levensvatbare celdichtheid (VCD) kunnen betrouwbaar en efficiënt worden gekwantificeerd door het gebied te berekenen dat door de cellen wordt bestreken en het gemiddelde gebied dat door een enkelvoudige cel wordt ingenomen. Het gebruik van thresholding in tegenstelling tot segmentatie voor celidentificatie maakte ook complexere analyses mogelijk, zoals experimenten waarin verschillende celtypen in coculturen tegelijkertijd werden geanalyseerd. NIH / 3T3 fibroblasten, die vaak blijken te colocaliseren met RAW264.7 macrofagen binnen een wondgenezingsplaats, bleken te groeien op een brandpuntsvlak dat zich onderscheidde van het brandpuntsvlak van macrofagen¹⁰. Dienovereenkomstig werden meerdere drempelalgoritmen uitgevoerd om de achtergrond en voorgrond te definiëren, afhankelijk van het celtype dat wordt geanalyseerd, waardoor nauwkeurig geteld kan worden van twee verschillende celtypen binnen dezelfde afbeelding.

Protocol

1. Celkweek en beeldverwerving Kweek RAW264.7 macrofagen bij 37 °C en 5% CO2 in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine, 1,5 g/l natriumbicarbonaat en 5 μM β-mercaptoethanol. Voor monocultuurbeeldvorming kweekt u RAW264.7-cellen met een dichtheid van 25.000 cellen/cm2 in een celkweekkolf van 5 ml met 1 ml medium. Kweek NIH/3T3 cellen bij 37 °C en 5% CO2 i…

Representative Results

Analyse van niet-bolvormige RAW264.7 macrofagen werd uitgevoerd in een monocultuur setting bij 25.000 cellen/cm2. Representatieve beelden werden gemaakt van de celcultuur en verwerkt in MATLAB na conversie naar 8-bit tiff in ImageJ. Algoritme-outputs gedurende het hele proces werden geregistreerd en gedocumenteerd in figuur 2 voor het representatieve beeld. In deze afbeelding telde het algoritme 226 cellen en dit aantal afbeeldingen werd geverifieerd door vergelijking met een hand…

Discussion

We ontwierpen een algemene gebiedsgerichte procedure die cellen nauwkeurig en efficiënt telde op basis van celhoogte, waardoor vlekvrije kwantificering van cellen mogelijk is, zelfs in cocultuursystemen. Kritische stappen voor deze procedure omvatten de implementatie van een systeem met relatieve intensiteit waarmee cellen konden worden gedifferentieerd. Het gebruik van een relatieve hoogteanalyse diende twee doelen: de behoefte aan externe parameters werd overbodig gemaakt, omdat relatieve parameters constant waren voo…

Materials

Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL – 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB – 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA