マクロファージ-線維芽細胞共培養の定量化のための領域ベースの画像解析アルゴリズム
Summary
我々は、細胞数を識別するために一般化可能な領域ベースの画像解析アプローチを利用する方法を提示する。異なる細胞集団の分析は、適応アルゴリズム内の異なる細胞型間の有意な細胞高さおよび構造の違いを利用した。
Abstract
細胞の定量化は、幅広い生物学的および生化学的研究に必要です。細胞の従来の画像解析では、通常、免疫蛍光染色や蛍光タンパク質によるトランスフェクション、またはエッジ検出技術などの蛍光検出アプローチのいずれかが採用されますが、これはノイズやその他の画像背景の不理想性のためにエラーが発生しやすいことがよくあります。
我々は、組織再生中にしばしば共局在化する異なる表現型の細胞であるマクロファージと線維芽細胞を正確に数えて区別できる新しいアルゴリズムを設計した。MATLABを使用してアルゴリズムを実装し、背景との身長の違いに基づいて異なる細胞タイプを区別しました。主要なアルゴリズムは、セルサイズ/構造と高密度シード条件の変動を説明するために、面積ベースの方法を使用して開発されました。
細胞構造における非理想性は、所与の細胞型の実験データを用いて計算された細胞被覆率などの内部パラメータを利用する二次的な反復アルゴリズムを用いて考慮された。最後に、画像内の相対的な高低差の評価に基づいて、様々な細胞型を選択的に除外した単離アルゴリズムを用いて、共存環境の分析を行った。このアプローチは、単一培養細胞では5%の誤差範囲内、共存細胞では10%の誤差範囲内の細胞を正確に計数することが判明した。
Introduction
画像解析技術中にソフトウェアが日常的に実装され、結果が正確、効率的、かつ偏りのないものになるようにします。細胞ベースのアッセイの場合、一般的な問題は細胞の誤同定です。焦点とコントラストの設定が不適切な画像では、細胞のぼやけが生じ、個々の細胞の境界が識別しにくくなる可能性があります1。毛穴、気泡、またはその他の望ましくない物体などの無関係な画像特徴の存在は、計数プロセスを遅らせ、誤識別につながることによって計数手順を妨げる可能性がある。さらに、細胞カウントは厄介な場合があり、数百回の反復のカウントは非常に時間がかかる可能性があります。さらに、手動計数中に固有の主観的バイアスが存在するため、細胞同定に関する意思決定はしばしば不正確である2。自動化されたソフトウェアは、研究者バイアスの影響を軽減する明確に定義された識別基準に基づいて、人間の正確な検出能力をはるかに超えた物体を含む無関係な物体から細胞を迅速かつ正確に区別することによって、これらすべての問題を回避するエキサイティングな可能性を提供します。自動化されたソフトウェアを使用して細胞を識別するための一般的な技術には、セグメンテーションと閾値化の2つの主要な方法が含まれます。ここでは、広くアクセス可能なソフトウェアフレームワーク内で迅速、正確、かつ安価なセルカウントを可能にする一般化可能な領域ベースのプロトコルを実証する。
エッジ検出などのセグメンテーション技術は、画像内の強度差を利用して個々の細胞を分離しようとします。セルを画像の残りの部分と区別する強度の変化は、ほとんどの場合、明るさの急激な変化で構成されています 4。エッジ検出には、正則化フィルタリングステップと、強度変化が検出される微分ステップが含まれます。分化プロセスは、高強度変化の画像内の辺および輪郭を識別し、これらの辺および輪郭は細胞の存在と相関している。ノイズの多い画像はノイズ除去アルゴリズム4で実行できますが、エッジ検出技術は背景ノイズの少ない画像の解析に理想的です。このプロセスは、細胞境界が明確かつ容易に区別可能であり、細胞の存在、細胞のぼやけ、無関係な物体、または定義された内部細胞構造1,2とは無関係の輝度輪郭によって妨げられない場合に最適に機能する。画像が特にノイズが多い場合、細胞は蛍光染色または蛍光タンパク質2,5によるトランスフェクションによってさらに区別され得る。これにより、セグメンテーション技術の精度が大幅に向上しますが、イメージング用の細胞培養物を準備するには、追加のコストと追加の時間投資が必要です。
閾値化手法では、画像を前景と背景の 2 つのカテゴリに分割し、セルを前景3 に割り当てます。これらの手法では、色/コントラストの変更を利用して、オブジェクトの見かけの高さを定義します。日常的に背景よりも「背が高い」オブジェクトは、セルとして簡単に識別できます。集水域変換は、サーフェスを明るいピクセルを前景、暗いピクセルを持つサーフェスを背景 6,7 に関連付けることによって、このように機能します。高さベースの識別を通じて、閾値化技術は、ノイズが同じ焦点面内に存在する限り、ノイズを所望のオブジェクトと日常的に区別することができる。エリアベースの定量化と組み合わせると、集水域変換は、エッジ検出などの一般的なセグメンテーション手法が不正確である環境でオブジェクトのグループを正確に識別できます。
集水域変換は、一般にセグメンテーション技術と組み合わせて、よりクリーンな解析のために画像を準備するため、セルカウントの精度が向上します。このプロセスでは、集水域変換を使用して、セグメンテーションの前に潜在的な関心領域を強調表示します。集水域変換は、画像の前景にあるセルを識別することによって独自の利点を提供し、背景の不均一なパッチなど、細胞の潜在的な偽陽性を除去することによってセグメンテーション分析の精度を向上させることができます。ただし、セルベースの画像を集水域変換に適応させようとすると、問題が発生する可能性があります。細胞密度の高い画像は、細胞の集合体が個々の成分としてではなく特異なグループとして識別される過小セグメンテーションに悩まされる可能性があります。ノイズや急激な強度変化の存在はまた、アルゴリズムが細胞を過剰に分離し、過剰で不正確な細胞数をもたらすオーバーセグメンテーションをもたらす可能性がある8。
ここでは、 図1に示すように、面積ベースの定量化アルゴリズム内に閾値化分析のコンポーネントを組み込むことによって、集水域変換の主な欠点を最小限に抑える方法を詳述します。特に、このアルゴリズムはオープンソースおよび/または広く利用可能なソフトウェアで実装され、この細胞計数フレームワークの適用は高価な試薬または複雑な細胞調製技術なしで可能であった。RAW264.7マクロファージは、結合組織維持および創傷治癒プロセスの調節におけるそれらの重要な役割のために、この方法を実証するために使用された9。さらに、NIH/3T3線維芽細胞は、組織の維持および修復において重要な役割を果たすため、分析された。線維芽細胞はしばしばマクロファージと共存し、サポートし、共存研究においてこれらの表現型的に異なる細胞型を区別する必要性を生じさせる。
高い生細胞密度(VCD)を有する画像からの細胞数は、細胞が被覆する面積と、特異な細胞が占める平均面積を計算することによって、確実かつ効率的に定量化することができた。細胞同定のためのセグメンテーションとは対照的に閾値化を使用することで、共存培養中の異なる細胞タイプを同時に分析する実験など、より複雑な分析も可能になりました。NIH/3T3線維芽細胞は、創傷治癒部位内でRAW264.7マクロファージと共局在することがしばしば見出され、マクロファージの焦点面とは異なる焦点面で増殖することが見出された10。したがって、複数の閾値化アルゴリズムを実行して、分析対象の細胞型に応じて背景と前景を定義し、同じ画像内の2つの異なる細胞型を正確にカウントすることができました。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞の高さに基づいて細胞を正確かつ効率的に計数する一般的な領域ベースの手順を設計し、共存系でも細胞の染色のない定量を可能にしました。この手順の重要なステップには、細胞を分化させることができる相対強度システムの実装が含まれていた。相対高さ分析の使用は、相対パラメータが特定のセルタイプとパラメータに対して一定であったため、外部パラメータの必要性が不要に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(R01 AR067247)とデラウェア州INBREプログラムによって部分的に資金提供され、国立衛生研究所とデラウェア州からの国立一般医科学研究所-NIGMS(P20 GM103446)からの助成金によって支援されました。原稿の内容は、必ずしも資金提供機関の見解を反映しているわけではありません。
Materials
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL – 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB – 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
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