Алгоритм анализа изображений на основе зон для количественной оценки кокультур макрофаг-фибробластов

Summary

Мы представляем метод, который использует обобщающий подход к анализу изображений на основе площади для определения количества клеток. Анализ различных клеточных популяций использовал значительные различия в высоте и структуре клеток между различными типами клеток в рамках адаптивного алгоритма.

Abstract

Количественная оценка клеток необходима для широкого спектра биологических и биохимических исследований. Обычный анализ изображений клеток обычно использует либо подходы к обнаружению флуоресценции, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание или трансфекция флуоресцентными белками или методы обнаружения краев, которые часто подвержены ошибкам из-за шума и других неидеальностей на фоне изображения.

Мы разработали новый алгоритм, который может точно подсчитывать и различать макрофаги и фибробласты, клетки разных фенотипов, которые часто колокализуются во время регенерации тканей. MATLAB был использован для реализации алгоритма, который дифференцировал различные типы клеток на основе различий в высоте от фона. Первичный алгоритм был разработан с использованием зонально-ориентированного метода для учета изменений в размере/структуре клеток и условиях посева с высокой плотностью.

Неидеальности в клеточных структурах были учтены с помощью вторичного, итеративного алгоритма, использующего внутренние параметры, такие как покрытие клеток, рассчитанное с использованием экспериментальных данных для данного типа клеток. Наконец, анализ сред кокультуры проводили с использованием алгоритма изоляции, в котором выборочно исключались различные типы клеток на основе оценки относительных перепадов высот внутри изображения. Было обнаружено, что этот подход точно подсчитывает клетки в пределах 5% погрешности для монокультурных клеток и в пределах 10% погрешности для кокутивируемых клеток.

Introduction

Программное обеспечение регулярно внедряется во время методов анализа изображений, чтобы гарантировать, что результаты являются точными, эффективными и непредвзятыми. Для клеточных анализов общей проблемой является неправильная идентификация клеток. Изображения с неправильными фокальными и контрастными настройками могут привести к размытию клеток, при котором границу отдельных клеток становится трудно идентифицировать¹. Наличие посторонних признаков изображения, таких как поры, пузырьки или другие нежелательные объекты, может затруднить процедуры подсчета, замедляя процесс подсчета и приводя к неправильной идентификации. Кроме того, подсчет клеток может быть обременительным, а подсчет сотен реплик может быть чрезвычайно трудоемким. Кроме того, при ручном подсчете существует присущая ему субъективная предвзятость, и поэтому принятие решений относительно идентификации клеток часто является неточным². Автоматизированное программное обеспечение предлагает захватывающий потенциал для обхода всех этих проблем путем быстрой и точной дифференциации клеток от посторонних объектов, включая объекты, далеко выходящие за пределы человеческих возможностей для точного обнаружения, на основе четко определенных критериев идентификации, которые уменьшают влияние предвзятости исследователя. Общие методы идентификации клеток с использованием автоматизированного программного обеспечения включают два основных метода: сегментацию и пороговое значение³. Здесь мы демонстрируем обобщаемый протокол на основе области, который обеспечивает быстрый, точный и недорогой подсчет клеток в широко доступной программной среде.

Методы сегментации, такие как обнаружение краев, направлены на изоляцию отдельных клеток, используя различия интенсивности в изображении. Изменения интенсивности, которые отличают клетку от остальной части изображения, чаще всего состоят из резких изменений яркости⁴. Обнаружение краев включает в себя этап регуляризации фильтрации, за которым следует этап дифференциации, на котором обнаруживаются изменения интенсивности. Процесс дифференцировки идентифицирует края и контуры в изображении высокоинтенсивных изменений, и эти края и контуры коррелируют с присутствием клеток. Хотя изображения с шумом могут быть запущены через алгоритмы шумоподавления⁴, методы обнаружения краев идеально используются для анализа изображений с низким фоновым шумом. Процесс функционирует оптимально, когда границы ячеек четко и легко различимы и не затруднены контурами яркости, не связанными с присутствием клеток, размытием клеток, посторонними объектами или определенными внутренними клеточными структурами ^1,2. Если изображение особенно шумное, клетки могут быть дополнительно различимы с помощью флуоресцентного окрашивания или трансфекции флуоресцентными белками ^2,5. Хотя это значительно повышает точность методов сегментации, это требует дополнительных затрат и дополнительных затрат времени для подготовки клеточных культур к визуализации.

Методы порогового значения включают разделение изображения на две категории: передний план и фон, причем ячейки назначаются переднему плану³. Эти методы используют изменения цвета/контраста для определения видимой высоты объекта; Объекты, которые обычно «выше», чем фон, могут быть легко идентифицированы как клетки. Водораздел функционирует таким образом, связывая поверхности со светлыми пикселями в качестве переднего плана и с темными пикселями в качестве фона ^6,7. Благодаря идентификации на основе высоты методы пороговых значений могут обычно отличать шум от желаемых объектов, при условии, что они существуют в одной фокальной плоскости. В сочетании с зональной количественной оценкой преобразование водораздела может точно идентифицировать группы объектов в средах, где типичные методы сегментации, такие как обнаружение краев, были бы неточными.

Водосборные преобразования обычно сочетаются с методами сегментации для подготовки изображений к более чистому анализу, что приводит к более высокой точности подсчета клеток. Для этого процесса преобразование водораздела используется для выделения потенциальных областей, представляющих интерес, до сегментации. Преобразование водораздела обеспечивает уникальные преимущества, идентифицируя клетки на переднем плане изображений, что может повысить точность анализа сегментации за счет удаления потенциальных ложных срабатываний для клеток, таких как неравномерные участки фона. Тем не менее, трудности могут возникнуть при попытке адаптировать изображения на основе клеток к преобразованию водораздела. Изображения с высокой плотностью клеток могут страдать от недостаточной сегрегации, в которой агрегаты клеток идентифицируются как единичная группа, а не как отдельные компоненты. Наличие шума или резких изменений интенсивности также может привести к пересегментации, при которой алгоритм переувлажняет клетки, что приводит к чрезмерному и неточному количеству клеток⁸.

Здесь мы подробно описываем метод минимизации первичных недостатков преобразования водораздела путем включения компонентов порогового анализа в алгоритм количественной оценки на основе площади, как показано на рисунке 1. Примечательно, что этот алгоритм был реализован с открытым исходным кодом и / или широко доступным программным обеспечением, и применение этой структуры подсчета клеток было возможно без дорогостоящих реагентов или сложных методов подготовки клеток. Макрофаги RAW264.7 были использованы для демонстрации метода в связи с их критической ролью в регуляции процессов поддержания соединительной ткани и заживления ран⁹. Кроме того, были проанализированы фибробласты NIH/3T3 из-за их ключевой роли в поддержании и восстановлении тканей. Клетки фибробластов часто сосуществуют с макрофагами и поддерживают их, что вызывает необходимость различать эти фенотипически различные типы клеток в исследованиях кокультуры.

Количество клеток из изображений с высокой жизнеспособной плотностью клеток (VCD) может быть количественно определено надежно и эффективно путем расчета площади, охватываемой клетками, и средней площади, занимаемой единственной ячейкой. Использование пороговых значений в отличие от сегментации для идентификации клеток также позволило провести более сложный анализ, такой как эксперименты, в которых одновременно анализировались различные типы клеток в кокультурах. Было обнаружено, что фибробласты NIH/3T3, которые часто колокализуются с макрофагами RAW264.7 в месте заживления ран, растут в фокальной плоскости, отличной от фокальной плоскости макрофагов¹⁰. Соответственно, было запущено несколько алгоритмов порогового значения для определения фона и переднего плана в зависимости от типа анализируемой ячейки, что позволило точно подсчитать два разных типа клеток в одном изображении.

Protocol

1. Клеточная культура и получение изображений Культивируйте макрофаги RAW264.7 при 37 °C и 5% CO2 в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина-стрептомицина, 1,5 г / л бикарбоната натрия и 5 мкМ β-меркаптоэтанола. Д…

Representative Results

Анализ нелюбковых макрофагов RAW264.7 проводили в монокультурных условиях при 25 000 клеток/см2. Репрезентативные изображения клеточной культуры были взяты и обработаны в MATLAB после преобразования в 8-битный tiff в ImageJ. Выходные данные алгоритма на протяжении всего процесса были записаны …

Discussion

Мы разработали общую зональную процедуру, которая точно и эффективно подсчитывала клетки на основе высоты клеток, что позволяло проводить количественное определение клеток без окрашивания даже в системах кокультуры. Критические шаги для этой процедуры включали реализацию системы от…

Materials

Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL – 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB – 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA