Algoritmo de análisis de imágenes basado en áreas para la cuantificación de cocultivos de macrófagos y fibroblastos

Summary

Presentamos un método, que utiliza un enfoque de análisis de imágenes basado en áreas generalizables para identificar los recuentos de células. El análisis de diferentes poblaciones celulares explotó las diferencias significativas de altura y estructura celular entre los distintos tipos de células dentro de un algoritmo adaptativo.

Abstract

La cuantificación de las células es necesaria para una amplia gama de estudios biológicos y bioquímicos. El análisis de imágenes convencional de las células generalmente emplea enfoques de detección de fluorescencia, como la tinción inmunofluorescente o la transfección con proteínas fluorescentes o técnicas de detección de bordes, que a menudo son propensas a errores debido al ruido y otras no idealidades en el fondo de la imagen.

Diseñamos un nuevo algoritmo que podría contar y distinguir con precisión macrófagos y fibroblastos, células de diferentes fenotipos que a menudo se colocalizan durante la regeneración de tejidos. SE UTILIZÓ MATLAB para implementar el algoritmo, que diferenció distintos tipos de células en función de las diferencias de altura del fondo. Se desarrolló un algoritmo primario utilizando un método basado en el área para tener en cuenta las variaciones en el tamaño / estructura de la célula y las condiciones de siembra de alta densidad.

Las no idealidades en las estructuras celulares se explicaron con un algoritmo secundario e iterativo que utiliza parámetros internos como la cobertura celular calculada utilizando datos experimentales para un tipo de célula determinado. Finalmente, se realizó un análisis de ambientes de cocultivo mediante un algoritmo de aislamiento en el que se excluyeron selectivamente varios tipos de células en base a la evaluación de las diferencias de altura relativa dentro de la imagen. Se encontró que este enfoque cuenta con precisión las células dentro de un margen de error del 5% para las células monocultivadas y dentro de un margen de error del 10% para las células cocultivadas.

Introduction

El software se implementa rutinariamente durante las técnicas de análisis de imágenes para garantizar que los resultados sean precisos, eficientes e imparciales. Para los ensayos basados en células, un problema común es la identificación errónea de las células. Las imágenes con ajustes focales y de contraste inadecuados pueden conducir a un desenfoque celular, en el que el límite de las células individuales se vuelve difícil de identificar¹. La presencia de características de imagen extrañas, como poros, burbujas u otros objetos no deseados, puede dificultar los procedimientos de conteo al ralentizar el proceso de conteo y provocar una identificación errónea. Además, el conteo de células puede ser oneroso, y contar cientos de réplicas puede llevar mucho tiempo. Además, existe un sesgo subjetivo inherente durante el conteo manual y, por lo tanto, la toma de decisiones con respecto a la identificación celular a menudo es inexacta². El software automatizado ofrece un potencial emocionante para evitar todos estos problemas al diferenciar rápida y precisamente las células de los objetos extraños, incluidos los objetos mucho más allá de la capacidad humana para una detección precisa, sobre la base de criterios de identificación bien definidos que reducen la influencia del sesgo del investigador. Las técnicas comunes para identificar células utilizando software automatizado implican dos métodos principales: segmentación y umbral³. Aquí, demostramos un protocolo generalizable basado en áreas que permite un conteo de células rápido, preciso y económico dentro de un marco de software ampliamente accesible.

Las técnicas de segmentación, como la detección de bordes, buscan aislar células individuales utilizando diferencias de intensidad dentro de una imagen. Los cambios de intensidad que distinguen una celda del resto de la imagen consisten con mayor frecuencia en cambios bruscos en el brillo⁴. La detección de bordes implica un paso de filtrado de regularización, seguido de un paso de diferenciación en el que se detectan cambios de intensidad. El proceso de diferenciación identifica bordes y contornos dentro de la imagen de cambios de alta intensidad, y estos bordes y contornos se correlacionan con la presencia celular. Aunque las imágenes con ruido se pueden ejecutar a través de algoritmos de denoising⁴, las técnicas de detección de bordes se utilizan idealmente para analizar imágenes con bajo ruido de fondo. El proceso funciona de manera óptima cuando los límites celulares son clara y fácilmente distinguibles y no se ven obstaculizados por contornos de brillo no relacionados con la presencia celular, el desenfoque celular, los objetos extraños o las estructuras celulares internas definidas ^1,2. Si una imagen es particularmente ruidosa, las células pueden distinguirse aún más a través de la tinción fluorescente o la transfección con proteínas fluorescentes ^2,5. Aunque esto mejora significativamente la precisión de las técnicas de segmentación, requiere costos adicionales e inversiones de tiempo adicionales para preparar cultivos celulares para imágenes.

Las técnicas de umbral implican la división de una imagen en dos categorías: el primer plano y el fondo, con celdas asignadas al primer plano³. Estas técnicas utilizan cambios de color/contraste para definir la altura aparente de un objeto; los objetos que son rutinariamente “más altos” que el fondo se pueden identificar fácilmente como células. La transformación de la divisoria de aguas funciona de esta manera asociando superficies con píxeles claros como primer plano y aquellos con píxeles oscuros como fondo ^6,7. A través de la identificación basada en la altura, las técnicas de umbral pueden distinguir rutinariamente el ruido de los objetos deseados, siempre que existan dentro del mismo plano focal. Cuando se combina con una cuantificación basada en el área, una transformación de cuenca puede identificar con precisión grupos de objetos en entornos donde las técnicas de segmentación típicas, como la detección de bordes, serían inexactas.

Las transformaciones de cuencas hidrográficas se combinan comúnmente con técnicas de segmentación para preparar imágenes para un análisis más limpio, lo que resulta en una mayor precisión del conteo de células. Para este proceso, la transformación de la cuenca se utiliza para resaltar las regiones potenciales de interés antes de la segmentación. Una transformada de cuenca proporciona beneficios únicos al identificar células en primer plano de las imágenes, lo que puede mejorar la precisión del análisis de segmentación al eliminar posibles falsos positivos para las células, como parches desiguales de fondo. Sin embargo, pueden surgir dificultades cuando se intenta adaptar imágenes basadas en células a una transformación de cuenca. Las imágenes con alta densidad celular pueden estar plagadas de subsegmentación, en la que los agregados de células se identifican como un grupo singular en lugar de como componentes individuales. La presencia de ruido o cambios bruscos de intensidad también pueden dar lugar a una sobresegmentación, en la que el algoritmo sobreisola las células, lo que resulta en recuentos celulares excesivos e inexactos⁸.

A continuación, detallamos un método para minimizar los inconvenientes primarios de la transformada de cuenca mediante la incorporación de componentes de un análisis de umbral dentro de un algoritmo de cuantificación basado en áreas, como se muestra en la Figura 1. En particular, este algoritmo se implementó con software de código abierto y / o ampliamente disponible, y la aplicación de este marco de conteo de células fue posible sin costosos reactivos o técnicas complejas de preparación celular. Se utilizaron macrófagos RAW264.7 para demostrar el método debido a su papel crítico en la regulación del mantenimiento del tejido conectivo y los procesos de cicatrización de heridas⁹. Además, se analizaron los fibroblastos NIH/3T3 debido a su papel clave en el mantenimiento y la reparación de tejidos. Las células de fibroblastos a menudo coexisten y apoyan a los macrófagos, generando la necesidad de distinguir estos tipos de células fenotípicamente distintas en los estudios de cocultivo.

Los recuentos de células a partir de imágenes con alta densidad celular viable (VCD) podrían cuantificarse de manera confiable y eficiente calculando el área cubierta por las células y el área promedio ocupada por una célula singular. El uso de umbrales en lugar de segmentación para la identificación celular también permitió análisis más complejos, como experimentos en los que se analizaron simultáneamente diferentes tipos de células en cocultivos. Se encontró que los fibroblastos NIH/3T3, que a menudo se encuentran para colocalizarse con macrófagos RAW264.7 dentro de un sitio de curación de heridas, crecen en un plano focal que era distinto del plano focal de los macrófagos¹⁰. En consecuencia, se ejecutaron múltiples algoritmos de umbral para definir el fondo y el primer plano dependiendo del tipo de celda que se estaba analizando, lo que permitió un conteo preciso de dos tipos de celdas diferentes dentro de la misma imagen.

Protocol

1. Cultivo celular y adquisición de imágenes Cultivo raw264.7 macrófagos a 37 °C y 5% de CO2 en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina, 1,5 g/L de bicarbonato de sodio y 5 μM de β-mercaptoetanol. Para imágenes de monocultivo, cultive células RAW264.7 a una densidad de 25.000 células/cm2 en un matraz de cultivo celular de 5 ml con 1 ml de medio. …

Representative Results

El análisis de macrófagos RAW264.7 no bulbosos se realizó en un entorno de monocultivo a 25.000 células/cm2. Se tomaron imágenes representativas del cultivo celular y se procesaron en MATLAB tras la conversión a tiff de 8 bits en ImageJ. Las salidas del algoritmo a lo largo del proceso se registraron y documentaron en la Figura 2 para la imagen representativa. En esta imagen, el algoritmo contó 226 celdas, y este recuento de imágenes se verificó en comparación con un rec…

Discussion

Diseñamos un procedimiento general basado en el área que contó las células de manera precisa y eficiente sobre la base de la altura de la célula, lo que permite la cuantificación sin manchas de las células incluso en sistemas de cocultivo. Los pasos críticos para este procedimiento incluyeron la implementación de un sistema de intensidad relativa por el cual las células podrían diferenciarse. El uso de un análisis de altura relativa sirvió para dos propósitos: la necesidad de parámetros externos se hizo in…

Materials

Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL – 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB – 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA