Områdebaseret billedanalysealgoritme til kvantificering af makrofagfibroblastkokulturer

Summary

Vi præsenterer en metode, der anvender en generaliserbar områdebaseret billedanalysemetode til at identificere celletal. Analyse af forskellige cellepopulationer udnyttede de signifikante cellehøjde- og strukturforskelle mellem forskellige celletyper inden for en adaptiv algoritme.

Abstract

Kvantificering af celler er nødvendig for en lang række biologiske og biokemiske undersøgelser. Konventionel billedanalyse af celler anvender typisk enten fluorescensdetektionsmetoder, såsom immunofluorescerende farvning eller transfektion med fluorescerende proteiner eller kantdetekteringsteknikker, som ofte er fejlbehæftede på grund af støj og andre ikke-idealiteter i billedbaggrunden.

Vi designede en ny algoritme, der nøjagtigt kunne tælle og skelne makrofager og fibroblaster, celler af forskellige fænotyper, der ofte colokaliserer under vævsregenerering. MATLAB blev brugt til at implementere algoritmen, som differentierede forskellige celletyper baseret på højdeforskelle fra baggrunden. En primær algoritme blev udviklet ved hjælp af en områdebaseret metode til at tage højde for variationer i cellestørrelse / struktur og såningsbetingelser med høj densitet.

Ikke-idealiteter i cellestrukturer blev redegjort for med en sekundær, iterativ algoritme ved hjælp af interne parametre såsom celledækning beregnet ved hjælp af eksperimentelle data for en given celletype. Endelig blev der udført en analyse af kokulturmiljøer ved hjælp af en isolationsalgoritme, hvor forskellige celletyper selektivt blev udelukket baseret på evalueringen af relative højdeforskelle i billedet. Denne tilgang viste sig at tælle celler nøjagtigt inden for en fejlmargen på 5% for monokultiverede celler og inden for en fejlmargen på 10% for kokulturerede celler.

Introduction

Software implementeres rutinemæssigt under billedanalyseteknikker for at sikre, at resultaterne er nøjagtige, effektive og upartiske. For cellebaserede assays er et almindeligt problem fejlidentifikation af celler. Billeder med forkerte brændvidde- og kontrastindstillinger kan føre til cellesløring, hvor grænsen for de enkelte celler bliver svær at identificere¹. Tilstedeværelsen af fremmede billedfunktioner såsom porer, bobler eller andre uønskede genstande kan hæmme tælleprocedurer ved at bremse tælleprocessen og føre til fejlidentifikation. Desuden kan celletælling være besværlig, og det kan være ekstremt tidskrævende at tælle hundredvis af replikater. Desuden eksisterer der en iboende subjektiv bias under manuel optælling, og derfor er beslutningstagning vedrørende celleidentifikation ofte unøjagtig². Automatiseret software giver spændende potentiale til at omgå alle disse problemer ved hurtigt og præcist at differentiere celler fra fremmede objekter, herunder objekter langt ud over menneskelig kapacitet til præcis detektion, baseret på veldefinerede identifikationskriterier, der reducerer indflydelsen fra efterforskerbias. Almindelige teknikker til at identificere celler ved hjælp af automatiseret software involverer to hovedmetoder: segmentering og tærskel³. Heri demonstrerer vi en generaliserbar områdebaseret protokol, der muliggør hurtig, nøjagtig og billig celletælling inden for en bredt tilgængelig softwareramme.

Segmenteringsteknikker, såsom kantdetektion, søger at isolere individuelle celler ved at bruge intensitetsforskelle i et billede. Intensitetsændringer, der adskiller en celle fra resten af billedet, består oftest af skarpe ændringer i lysstyrke⁴. Kantdetektion involverer et regulerende filtreringstrin efterfulgt af et differentieringstrin, hvor intensitetsændringer registreres. Differentieringsprocessen identificerer kanter og konturer i billedet af ændringer med høj intensitet, og disse kanter og konturer er korreleret med celletilstedeværelse. Selvom billeder med støj kan køres gennem denoisingalgoritmer⁴, bruges kantdetekteringsteknikker ideelt til at analysere billeder med lav baggrundsstøj. Processen fungerer optimalt, når cellegrænser er klart og let at skelne og ikke hæmmes af lysstyrkekonturer, der ikke er relateret til celletilstedeværelse, cellesløring, fremmede objekter eller definerede interne cellestrukturer ^1,2. Hvis et billede er særligt støjende, kan celler yderligere skelnes gennem fluorescerende farvning eller transfektion med fluorescerende proteiner ^2,5. Selvom dette forbedrer nøjagtigheden af segmenteringsteknikker betydeligt, kræver det ekstra omkostninger og yderligere tidsinvesteringer at forberede cellekulturer til billeddannelse.

Tærskelteknikker involverer opdeling af et billede i to kategorier: forgrunden og baggrunden med celler tildelt forgrunden³. Disse teknikker bruger farve / kontrastændringer til at definere den tilsyneladende højde af et objekt; objekter, der rutinemæssigt er ‘højere’ end baggrunden, kan let identificeres som celler. Vandskel-transformationen fungerer på denne måde ved at forbinde overflader med lyse pixels som forgrunden og dem med mørke pixels som baggrund ^6,7. Gennem højdebaseret identifikation kan tærskelteknikker rutinemæssigt skelne støj fra ønskede objekter, forudsat at de findes inden for samme brændplan. Når den parres med en områdebaseret kvantificering, kan en vandskeltransformation nøjagtigt identificere grupper af objekter i miljøer, hvor typiske segmenteringsteknikker såsom kantdetektion ville være unøjagtige.

Vandskel-transformationer kombineres almindeligvis med segmenteringsteknikker for at forberede billeder til en renere analyse, hvilket resulterer i højere nøjagtighed af celletælling. Til denne proces bruges vandområde-transformationen til at fremhæve potentielle regioner af interesse inden segmentering. En vandskel-transformation giver unikke fordele ved at identificere celler i forgrunden af billeder, hvilket kan forbedre nøjagtigheden af segmenteringsanalyse ved at fjerne potentielle falske positiver for celler, såsom ujævne baggrundspletter. Der kan dog opstå vanskeligheder, når man forsøger at tilpasse cellebaserede billeder til en vandskel-transformation. Billeder med høj celletæthed kan være plaget af undersegmentering, hvor aggregater af celler identificeres som en enkelt gruppe snarere end som individuelle komponenter. Tilstedeværelsen af støj eller skarpe intensitetsændringer kan også resultere i oversegmentering, hvor algoritmen overisolerer celler, hvilket resulterer i overdrevne og unøjagtige celletal⁸.

Heri beskriver vi en metode til at minimere de primære ulemper ved vandskeltransformationen ved at inkorporere komponenter i en tærskelanalyse i en områdebaseret kvantificeringsalgoritme, som vist i figur 1. Især blev denne algoritme implementeret med open source og / eller bredt tilgængelig software, og anvendelse af denne celletællingsramme var mulig uden dyre reagenser eller komplekse celleforberedelsesteknikker. RAW264.7 makrofager blev brugt til at demonstrere metoden på grund af deres kritiske rolle i reguleringen af bindevævsvedligeholdelse og sårhelingsprocesser⁹. Derudover blev NIH / 3T3 fibroblaster analyseret på grund af deres nøglerolle i vævsvedligeholdelse og reparation. Fibroblastceller eksisterer ofte sammen med og understøtter makrofager, hvilket skaber behovet for at skelne mellem disse fænotypisk forskellige celletyper i kokulturundersøgelser.

Celletællinger fra billeder med høj levedygtig celletæthed (VCD) kunne kvantificeres pålideligt og effektivt ved at beregne det område, der er dækket af cellerne, og det gennemsnitlige område, der er optaget af en enkelt celle. Brugen af tærskelværdi i modsætning til segmentering til celleidentifikation muliggjorde også mere komplekse analyser, såsom eksperimenter, hvor forskellige celletyper i kokulturer blev analyseret samtidigt. NIH / 3T3 fibroblaster, som ofte viser sig at colokalisere med RAW264.7 makrofager inden for et sårhelingssted, viste sig at vokse på et brændplan, der var forskelligt fra fokusplanet for makrofager¹⁰. Derfor blev der kørt flere tærskelalgoritmer for at definere baggrunden og forgrunden afhængigt af den celletype, der analyseres, hvilket muliggør nøjagtig optælling af to forskellige celletyper inden for det samme billede.

Protocol

1. Cellekultur og billedoptagelse Kultur RAW264,7 makrofager ved 37 °C og 5 % CO2 i Dulbeccos modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10 % føtalt kvægserum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin, 1,5 g/l natriumbicarbonat og 5 μM β-mercaptoethanol. Til monokulturbilleddannelse dyrkes RAW264,7-celler med en massetæthed på 25.000 celler/cm2 i en 5 ml cellekulturkolbe med 1 ml medium. Dyrkning NIH/3T3-celler ved 37 °C og 5 % CO2</sub…

Representative Results

Analyse af ikke-pæreformede RAW264.7 makrofager blev udført i en monokulturindstilling ved 25.000 celler /cm2. Repræsentative billeder blev taget af cellekulturen og behandlet i MATLAB efter konvertering til 8-bit tiff i ImageJ. Algoritmeoutput under hele processen blev registreret og dokumenteret i figur 2 for det repræsentative billede. På dette billede talte algoritmen 226 celler, og dette billedantal blev verificeret ved sammenligning med et manuelt antal, der identificer…

Discussion

Vi designede en generel områdebaseret procedure, der nøjagtigt og effektivt tællede celler på basis af cellehøjde, hvilket muliggør pletfri kvantation af celler, selv i kokultursystemer. Kritiske trin for denne procedure omfattede implementering af et relativt intensitetssystem, hvormed celler kunne differentieres. Brugen af en relativ højdeanalyse tjente to formål: Behovet for eksterne parametre blev gjort unødvendigt, da relative parametre var konstante for den givne celletype og parameter, og absolut lysstyrk…

Materials

Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL – 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB – 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA