मैक्रोफेज-फाइब्रोब्लास्ट Cocultures के परिमाणीकरण के लिए क्षेत्र-आधारित छवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म
Summary
हम एक विधि प्रस्तुत करते हैं, जो सेल की गिनती की पहचान करने के लिए एक सामान्यीकृत क्षेत्र-आधारित छवि विश्लेषण दृष्टिकोण का उपयोग करता है। विभिन्न सेल आबादी के विश्लेषण ने एक अनुकूली एल्गोरिथ्म के भीतर अलग-अलग सेल प्रकारों के बीच महत्वपूर्ण सेल ऊंचाई और संरचना अंतर का शोषण किया।
Abstract
कोशिकाओं का परिमाणीकरण जैविक और जैव रासायनिक अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए आवश्यक है। कोशिकाओं का पारंपरिक छवि विश्लेषण आमतौर पर या तो प्रतिदीप्ति का पता लगाने के दृष्टिकोण को नियोजित करता है, जैसे कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन या किनारे का पता लगाने की तकनीकों के साथ इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग या अभिकर्मक, जो अक्सर छवि पृष्ठभूमि में शोर और अन्य गैर-आदर्शों के कारण त्रुटि-प्रवण होते हैं।
हमने एक नया एल्गोरिथ्म डिज़ाइन किया है जो मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट्स, विभिन्न फेनोटाइप्स की कोशिकाओं को सटीक रूप से गिन सकता है और अलग कर सकता है जो अक्सर ऊतक पुनर्जनन के दौरान सह-स्थानीयकरण करते हैं। MATLAB का उपयोग एल्गोरिथ्म को लागू करने के लिए किया गया था, जो पृष्ठभूमि से ऊंचाई में अंतर के आधार पर अलग-अलग सेल प्रकारों को विभेदित करता है। सेल आकार / संरचना और उच्च घनत्व सीडिंग स्थितियों में भिन्नताओं के लिए खाते के लिए एक क्षेत्र-आधारित विधि का उपयोग करके एक प्राथमिक एल्गोरिथ्म विकसित किया गया था।
सेल संरचनाओं में गैर-आदर्शताओं को एक द्वितीयक, पुनरावर्ती एल्गोरिथ्म के साथ जिम्मेदार ठहराया गया था, जो आंतरिक मापदंडों का उपयोग करता था जैसे कि सेल कवरेज किसी दिए गए सेल प्रकार के लिए प्रयोगात्मक डेटा का उपयोग करके गणना की जाती है। अंत में, एक अलगाव एल्गोरिथ्म का उपयोग करके कोकल्चर वातावरण का विश्लेषण किया गया था जिसमें छवि के भीतर सापेक्ष ऊंचाई के अंतर के मूल्यांकन के आधार पर विभिन्न सेल प्रकारों को चुनिंदा रूप से बाहर रखा गया था। यह दृष्टिकोण मोनोकल्चर्ड कोशिकाओं के लिए 5% त्रुटि मार्जिन के भीतर और सहसंस्कृत कोशिकाओं के लिए 10% त्रुटि मार्जिन के भीतर कोशिकाओं को सटीक रूप से गिनने के लिए पाया गया था।
Introduction
सॉफ़्टवेयर को नियमित रूप से छवि विश्लेषण तकनीकों के दौरान लागू किया जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि परिणाम सटीक, कुशल और निष्पक्ष हैं। सेल-आधारित assays के लिए, एक आम समस्या कोशिकाओं की गलत पहचान है। अनुचित फोकल और कंट्रास्ट सेटिंग्स वाली छवियों से सेल धुंधलापन हो सकता है, जिसमें व्यक्तिगत कोशिकाओं की सीमा1 की पहचान करना मुश्किल हो जाता है। बाहरी छवि सुविधाओं जैसे कि छिद्रों, बुलबुले, या अन्य अवांछित वस्तुओं की उपस्थिति गिनती प्रक्रिया को धीमा करके और गलत पहचान के लिए अग्रणी करके गिनती प्रक्रियाओं को बाधित कर सकती है। इसके अलावा, सेल की गिनती कठिन हो सकती है, और सैकड़ों प्रतिकृतियों की गिनती बेहद समय लेने वाली हो सकती है। इसके अलावा, मैन्युअल गिनती के दौरान एक अंतर्निहित व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह मौजूद है, और इसलिए सेल पहचान के बारे में निर्णय लेना अक्सर गलतहोता है। स्वचालित सॉफ़्टवेयर बाहरी वस्तुओं से कोशिकाओं को तेजी से और सटीक रूप से अलग करके इन सभी मुद्दों को बाईपास करने की रोमांचक क्षमता प्रदान करता है, जिसमें सटीक पहचान के लिए मानव क्षमता से परे वस्तुएं शामिल हैं, जो अच्छी तरह से परिभाषित पहचान मानदंडों के आधार पर हैं जो अन्वेषक पूर्वाग्रह के प्रभाव को कम करती हैं। स्वचालित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कोशिकाओं की पहचान करने के लिए सामान्य तकनीकों में दो मुख्य तरीके शामिल हैं: विभाजन और थ्रेशोल्डिंग3। इसमें, हम एक सामान्यीकृत क्षेत्र-आधारित प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं जो व्यापक रूप से सुलभ सॉफ़्टवेयर ढांचे के भीतर तेजी से, सटीक और सस्ती सेल गिनती को सक्षम बनाता है।
विभाजन तकनीक, जैसे कि किनारे का पता लगाना, एक छवि के भीतर तीव्रता अंतर का उपयोग करके अलग-अलग कोशिकाओं को अलग करना चाहते हैं। तीव्रता परिवर्तन जो एक सेल को बाकी छवि से अलग करते हैं, अक्सर चमक 4 में तेज परिवर्तन होतेहैं। एज डिटेक्शन में एक नियमितीकरण फ़िल्टरिंग चरण शामिल होता है, जिसके बाद एक भेदभाव चरण होता है जिसमें तीव्रता परिवर्तन का पता लगाया जाता है। विभेदन प्रक्रिया उच्च तीव्रता वाले परिवर्तनों की छवि के भीतर किनारों और रूपरेखा की पहचान करती है, और ये किनारे और रूपरेखा सेल की उपस्थिति के साथ सहसंबद्ध हैं। यद्यपि शोर के साथ छवियों को डीनोइज़िंग एल्गोरिदम4 के माध्यम से चलाया जा सकता है, लेकिन एज डिटेक्शन तकनीकों का उपयोग आदर्श रूप से कम पृष्ठभूमि शोर वाली छवियों का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। प्रक्रिया बेहतर ढंग से कार्य करती है जब सेल सीमाएं स्पष्ट रूप से और आसानी से अलग-अलग होती हैं और सेल उपस्थिति, सेल धुंधला, बाहरी वस्तुओं, या परिभाषित आंतरिक सेल संरचनाओं 1,2 से असंबंधित चमक की रूपरेखा से बाधित नहीं होती हैं। यदि कोई छवि विशेष रूप से शोर है, तो कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट प्रोटीन 2,5 के साथ फ्लोरोसेंट स्टेनिंग या अभिकर्मक के माध्यम से आगे प्रतिष्ठित किया जा सकता है। यद्यपि यह विभाजन तकनीकों की सटीकता में काफी सुधार करता है, लेकिन इमेजिंग के लिए सेल संस्कृतियों को तैयार करने के लिए अतिरिक्त लागत और अतिरिक्त समय निवेश की आवश्यकता होती है।
थ्रेशोल्डिंग तकनीकों में एक छवि को दो श्रेणियों में विभाजित किया जाता है: अग्रभूमि और पृष्ठभूमि, अग्रभूमि3 को असाइन की गई कोशिकाओं के साथ। ये तकनीकें किसी वस्तु की स्पष्ट ऊंचाई को परिभाषित करने के लिए रंग / कंट्रास्ट परिवर्तनों का उपयोग करती हैं; जिन वस्तुओं को नियमित रूप से पृष्ठभूमि की तुलना में ‘लंबा’ किया जाता है, उन्हें आसानी से कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है। वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म इस तरह से प्रकाश पिक्सेल के साथ सतहों को अग्रभूमि के रूप में और अंधेरे पिक्सेल वाले लोगों को पृष्ठभूमि 6,7 के रूप में जोड़कर कार्य करता है। ऊंचाई-आधारित पहचान के माध्यम से, थ्रेशोल्डिंग तकनीक नियमित रूप से वांछित वस्तुओं से शोर को अलग कर सकती है, बशर्ते वे एक ही फोकल प्लेन के भीतर मौजूद हों। जब क्षेत्र-आधारित परिमाणीकरण के साथ जोड़ा जाता है, तो एक वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म वातावरण में वस्तुओं के समूहों की सटीक पहचान कर सकता है जहां किनारे का पता लगाने जैसी विशिष्ट विभाजन तकनीकें गलत होंगी।
वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म को आमतौर पर क्लीनर विश्लेषण के लिए छवियों को तैयार करने के लिए विभाजन तकनीकों के साथ युग्मित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप सेल गिनती की उच्च सटीकता होती है। इस प्रक्रिया के लिए, वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म का उपयोग विभाजन से पहले ब्याज के संभावित क्षेत्रों को उजागर करने के लिए किया जाता है। एक वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म छवियों के अग्रभूमि में कोशिकाओं की पहचान करके अद्वितीय लाभ प्रदान करता है, जो कोशिकाओं के लिए संभावित झूठे सकारात्मक को हटाकर विभाजन विश्लेषण की सटीकता में सुधार कर सकता है, जैसे कि पृष्ठभूमि के असमान पैच। हालांकि, एक वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म के लिए सेल-आधारित छवियों को अनुकूलित करने का प्रयास करते समय कठिनाइयां उत्पन्न हो सकती हैं। उच्च सेल घनत्व वाली छवियों को अंडरसेग्मेंटेशन से ग्रस्त किया जा सकता है, जिसमें कोशिकाओं के समुच्चय को व्यक्तिगत घटकों के बजाय एक विलक्षण समूह के रूप में पहचाना जाता है। शोर या तेज तीव्रता परिवर्तनों की उपस्थिति के परिणामस्वरूप ओवरसेग्मेंटेशन भी हो सकता है, जिसमें एल्गोरिथ्म कोशिकाओं को ओवरआइसोलेट करता है, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक और गलत सेल की गिनतीहोती है 8।
इसमें, हम एक क्षेत्र-आधारित परिमाणीकरण एल्गोरिथ्म के भीतर थ्रेशोल्डिंग विश्लेषण के घटकों को शामिल करके वाटरशेड-ट्रांसफॉर्म की प्राथमिक कमियों को कम करने के लिए एक विधि का विस्तार करते हैं, जैसा कि चित्र 1 में दर्शाया गया है। विशेष रूप से, इस एल्गोरिथ्म को ओपन-सोर्स और / या व्यापक रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर के साथ लागू किया गया था, और इस सेल-गिनती ढांचे का आवेदन महंगे अभिकर्मकों या जटिल सेल तैयारी तकनीकों के बिना संभव था। RAW264.7 मैक्रोफेज का उपयोग संयोजी ऊतक रखरखाव और घाव भरने की प्रक्रियाओं को विनियमित करने में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण विधि को प्रदर्शित करने के लिए किया गयाथा। इसके अतिरिक्त, ऊतक रखरखाव और मरम्मत में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण एनआईएच / 3 टी 3 फाइब्रोब्लास्ट का विश्लेषण किया गया था। फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं अक्सर मैक्रोफेज के साथ सह-अस्तित्व में रहती हैं और उनका समर्थन करती हैं, जिससे कोकल्चर अध्ययनों में इन फेनोटाइपिक रूप से अलग-अलग सेल प्रकारों को अलग करने की आवश्यकता होती है।
उच्च व्यवहार्य सेल घनत्व (वीसीडी) के साथ छवियों से सेल की गिनती को कोशिकाओं द्वारा कवर किए गए क्षेत्र की गणना करके मज़बूती से और कुशलतासे परिमाणित किया जा सकता है, और एक विलक्षण सेल द्वारा कब्जा किए गए औसत क्षेत्र। सेल पहचान के लिए विभाजन के विपरीत थ्रेशोल्डिंग के उपयोग ने अधिक जटिल विश्लेषणों को भी सक्षम किया, जैसे कि प्रयोग जिसमें सहसंस्कृतियों में विभिन्न सेल प्रकारों का समवर्ती रूप से विश्लेषण किया गया था। एनआईएच / 3टी 3 फाइब्रोब्लास्ट्स, जो अक्सर घाव भरने वाली साइट के भीतर RAW264.7 मैक्रोफेज के साथ सह-स्थानीयकरण करने के लिए पाए जाते हैं, को एक फोकल प्लेन में विकसित होने के लिए पाया गया था जो मैक्रोफेज10 के फोकल प्लेन से अलग था। तदनुसार, विश्लेषण किए जा रहे सेल प्रकार के आधार पर पृष्ठभूमि और अग्रभूमि को परिभाषित करने के लिए कई थ्रेशोल्डिंग एल्गोरिदम चलाए गए थे, जिससे एक ही छवि के भीतर दो अलग-अलग सेल प्रकारों की सटीक गिनती सक्षम हो गई थी।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने एक सामान्य क्षेत्र-आधारित प्रक्रिया तैयार की है जो सेल की ऊंचाई के आधार पर कोशिकाओं को सटीक और कुशलतासे गिनती करती है, जिससे कोकल्चर सिस्टम में भी कोशिकाओं की दाग-मुक्त मात्रा की अनुमति मिलती है। ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 AR067247) द्वारा भाग में वित्त पोषित किया गया था और डेलावेयर INBRE कार्यक्रम द्वारा भाग में, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और डेलावेयर राज्य से राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान-NIGMS (P20 GM103446) से अनुदान द्वारा समर्थित था। पांडुलिपि की सामग्री आवश्यक रूप से वित्त पोषण एजेंसियों के विचारों को प्रतिबिंबित नहीं करती है।
Materials
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL – 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB – 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
References
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