Områdesbaserad bildanalysalgoritm för kvantifiering av makrofag-fibroblastkokulturer

Summary

Vi presenterar en metod som använder en generaliserbar områdesbaserad bildanalysmetod för att identifiera cellantal. Analys av olika cellpopulationer utnyttjade de signifikanta cellhöjds- och strukturskillnaderna mellan distinkta celltyper inom en adaptiv algoritm.

Abstract

Kvantifiering av celler är nödvändig för ett brett spektrum av biologiska och biokemiska studier. Konventionell bildanalys av celler använder vanligtvis antingen fluorescensdetekteringsmetoder, såsom immunofluorescerande färgning eller transfektion med fluorescerande proteiner eller kantdetekteringstekniker, som ofta är felbenägna på grund av brus och andra icke-idealiteter i bildbakgrunden.

Vi designade en ny algoritm som exakt kunde räkna och skilja makrofager och fibroblaster, celler av olika fenotyper som ofta samlokaliseras under vävnadsregenerering. MATLAB användes för att implementera algoritmen, som differentierade distinkta celltyper baserat på höjdskillnader från bakgrunden. En primär algoritm utvecklades med hjälp av en arealbaserad metod för att ta hänsyn till variationer i cellstorlek/struktur och såddförhållanden med hög densitet.

Icke-idealiteter i cellstrukturer redovisades med en sekundär, iterativ algoritm som använde interna parametrar såsom celltäckning beräknad med hjälp av experimentella data för en given celltyp. Slutligen genomfördes en analys av samodlingsmiljöer med hjälp av en isoleringsalgoritm där olika celltyper selektivt uteslöts baserat på utvärderingen av relativa höjdskillnader i bilden. Detta tillvägagångssätt visade sig exakt räkna celler inom en 5% felmarginal för monokulturerade celler och inom en 10% felmarginal för samodlingade celler.

Introduction

Programvara implementeras rutinmässigt under bildanalystekniker för att säkerställa att resultaten är korrekta, effektiva och opartiska. För cellbaserade analyser är ett vanligt problem felidentifiering av celler. Bilder med felaktiga fokal- och kontrastinställningar kan leda till celloskärpa, där gränsen för enskilda celler blir svår att identifiera¹. Förekomsten av främmande bildfunktioner som porer, bubblor eller andra oönskade föremål kan hindra räkningsprocedurer genom att sakta ner räkningsprocessen och leda till felidentifiering. Dessutom kan cellräkning vara betungande, och att räkna hundratals replikat kan vara extremt tidskrävande. Dessutom finns en inneboende subjektiv bias under manuell räkning, och därför är beslutsfattandet om cellidentifiering ofta felaktigt². Automatiserad programvara erbjuder spännande potential att kringgå alla dessa problem genom att snabbt och exakt skilja celler från främmande objekt, inklusive objekt långt bortom mänsklig kapacitet för exakt upptäckt, baserat på väldefinierade identifieringskriterier som minskar påverkan av utredarens partiskhet. Vanliga tekniker för att identifiera celler med hjälp av automatiserad programvara involverar två huvudmetoder: segmentering och tröskel³. Här visar vi ett generaliserbart områdesbaserat protokoll som möjliggör snabb, exakt och billig cellräkning inom ett allmänt tillgängligt programvaruramverk.

Segmenteringstekniker, såsom kantdetektering, försöker isolera enskilda celler genom att använda intensitetsskillnader i en bild. Intensitetsförändringar som skiljer en cell från resten av bilden består oftast av skarpa förändringar i ljusstyrka⁴. Kantdetektering innebär ett regulariserande filtreringssteg, följt av ett differentieringssteg där intensitetsförändringar detekteras. Differentieringsprocessen identifierar kanter och konturer inom bilden av högintensiva förändringar, och dessa kanter och konturer är korrelerade med cellnärvaro. Även om bilder med brus kan köras genom denoisingalgoritmer⁴, används kantdetekteringstekniker idealiskt för att analysera bilder med lågt bakgrundsbrus. Processen fungerar optimalt när cellgränserna är tydligt och lätta att urskilja och inte hindras av ljusstyrkekonturer som inte är relaterade till cellnärvaro, celloskärpa, främmande objekt eller definierade interna cellstrukturer ^1,2. Om en bild är särskilt bullrig kan celler särskiljas ytterligare genom fluorescerande färgning eller transfektion med fluorescerande proteiner ^2,5. Även om detta avsevärt förbättrar noggrannheten i segmenteringstekniker, kräver det extra kostnader och ytterligare tidsinvesteringar för att förbereda cellkulturer för avbildning.

Tröskeltekniker innebär uppdelning av en bild i två kategorier: förgrunden och bakgrunden, med celler tilldelade förgrunden³. Dessa tekniker använder färg- / kontrastförändringar för att definiera den uppenbara höjden på ett objekt; objekt som rutinmässigt är “högre” än bakgrunden kan lätt identifieras som celler. Vattendelaren-transformering fungerar på detta sätt genom att associera ytor med ljusa pixlar som förgrund och de med mörka pixlar som bakgrund ^6,7. Genom höjdbaserad identifiering kan tröskeltekniker rutinmässigt skilja brus från önskade objekt, förutsatt att de finns inom samma fokalplan. När den paras ihop med en områdesbaserad kvantifiering kan en vattendelare-transform exakt identifiera grupper av objekt i miljöer där typiska segmenteringstekniker som kantdetektering skulle vara felaktiga.

Watershed-transforms kombineras vanligtvis med segmenteringstekniker för att förbereda bilder för en renare analys, vilket resulterar i högre noggrannhet i cellräkningen. För denna process används vattendomstransformationen för att markera potentiella regioner av intresse före segmentering. En vattendelare-transform ger unika fördelar genom att identifiera celler i förgrunden av bilder, vilket kan förbättra noggrannheten i segmenteringsanalysen genom att ta bort potentiella falska positiva för celler, såsom ojämna fläckar av bakgrund. Svårigheter kan dock uppstå när man försöker anpassa cellbaserade bilder till en vattendelare-transform. Bilder med hög celldensitet kan plågas av undersegmentering, där aggregat av celler identifieras som en singulär grupp snarare än som enskilda komponenter. Förekomsten av brus eller skarpa intensitetsförändringar kan också resultera i översegmentering, där algoritmen överisolerar celler, vilket resulterar i överdrivna och felaktiga cellantal⁸.

Här beskriver vi en metod för att minimera de primära nackdelarna med vattendomstransformationen genom att införliva komponenter i en tröskelanalys inom en områdesbaserad kvantifieringsalgoritm, som visas i figur 1. I synnerhet implementerades denna algoritm med öppen källkod och / eller allmänt tillgänglig programvara, och tillämpningen av detta cellräkningsramverk var möjlig utan dyra reagenser eller komplexa cellberedningstekniker. RAW264.7 makrofager användes för att demonstrera metoden på grund av deras kritiska roll för att reglera bindvävsunderhåll och sårläkningsprocesser⁹. Dessutom analyserades NIH / 3T3 fibroblaster på grund av deras nyckelroll i vävnadsunderhåll och reparation. Fibroblastceller samexisterar ofta med och stöder makrofager, vilket genererar behovet av att skilja dessa fenotypiskt distinkta celltyper i samodlingsstudier.

Cellantal från bilder med hög viabla celldensitet (VCD) kan kvantifieras på ett tillförlitligt och effektivt sätt genom att beräkna det område som täcks av cellerna och det genomsnittliga området som upptas av en singulär cell. Användningen av tröskel i motsats till segmentering för cellidentifiering möjliggjorde också mer komplexa analyser, såsom experiment där olika celltyper i kokulturer analyserades samtidigt. NIH / 3T3-fibroblaster, som ofta visar sig samlokalisera med RAW264.7-makrofager inom ett sårläkningsställe, befanns växa vid ett fokalplan som skilde sig från fokalplanet för makrofager¹⁰. Följaktligen kördes flera tröskelalgoritmer för att definiera bakgrunden och förgrunden beroende på vilken celltyp som analyserades, vilket möjliggjorde exakt räkning av två olika celltyper inom samma bild.

Protocol

1. Cellodling och bildförvärv Odling RAW264,7 makrofager vid 37 °C och 5 % CO2 i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS), 1 % penicillinstreptomycin, 1,5 g/l natriumbikarbonat och 5 μM β-merkaptoetanol. För monokulturavbildning, odla RAW264.7-celler med en densitet av 25 000 celler / cm2 i en 5 ml cellodlingskolv med 1 ml medium. Odling NIH/3T3-celler vid 37 °C och 5 % CO2 i DME…

Representative Results

Analys av icke-bulbösa RAW264.7-makrofager utfördes i monokulturmiljö vid 25 000 celler/cm2. Representativa bilder togs av cellkulturen och bearbetades i MATLAB efter konvertering till 8-bitars tiff i ImageJ. Algoritmutdata under hela processen registrerades och dokumenterades i figur 2 för den representativa bilden. I den här bilden räknade algoritmen 226 celler, och detta bildantal verifierades genom jämförelse med ett manuellt antal som identifierade 241 celler (6,2% fe…

Discussion

Vi utformade en allmän områdesbaserad procedur som exakt och effektivt räknade celler på grundval av cellhöjd, vilket möjliggjorde fläckfri kvantitation av celler även i samodlingssystem. Kritiska steg för denna procedur inkluderade genomförandet av ett relativt intensitetssystem genom vilket celler kunde differentieras. Användningen av en relativ höjdanalys tjänade två syften: behovet av externa parametrar gjordes onödigt, eftersom relativa parametrar var konstanta för den givna celltypen och parametern,…

Materials

Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL – 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB – 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA