التألق بين الأطوار في الموقع تهجين مسحات نخاع العظم من المايلوما المتعددة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لتحسين نجاح التألق بين المراحل في الكشف عن التهجين في الموقع على مسحات نخاع العظم من مرضى المايلوما المتعددة.
Abstract
يعد الكشف عن التهجين الفلوري في الموقع (FISH) طريقة لا غنى عنها في التقسيم الطبقي للمخاطر الجينية في الورم النقوي المتعدد (MM) ، وهو أحد أكثر الأورام الخبيثة الدموية شيوعا. السمة المميزة ل MM هي خلايا البلازما الخبيثة المتراكمة في نخاع العظام. تركز تقارير FISH ل MM بشكل أساسي على خلايا البلازما النسيلية النقية أو المحددة ، بدلا من جميع الخلايا النووية ، عن طريق الفرز باستخدام الخرز المغناطيسي المضاد ل CD138 أو وضع علامة باستخدام سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي السيتوبلازمي κ أو λ. عادة ما يتم الحصول على نوى نخاع العظم بين الأطوار من خلايا نخاع العظم الطازجة. ومع ذلك ، فإن التخصيب المرضي لعينات خلايا البلازما يتطلب كميات كبيرة من نخاع العظم الطازج المضاد للتخثر الهيبارين ، والذي لا يمكن الحصول عليه في حالة استخراج نخاع العظم الصعب أو الصنبور الجاف لنخاع العظم. هنا ، نقوم بإنشاء طريقة جديدة لتحسين نجاح اكتشاف FISH على مسحات نخاع العظم الملطخة أو غير الملطخة. من الأسهل الحصول على مسحات نخاع العظم من عينات نخاع العظم المضادة للتخثر.
Introduction
الورم النقوي المتعدد (MM) هو مرض خبيث في خلايا البلازما (PC) مع عدم تجانس بيولوجي قوي وفروق فردية كبيرة في الفعالية السريرية ، مع فترات بقاء تتراوح من أشهر إلى عقود. الخصائص الوراثية الخلوية هي مؤشرات تنبؤية مهمة ل MM. أصبح نظام التقسيم الطبقي للمخاطر والعلاجات الفردية القائمة على الخصائص الوراثية موضوعين ذوي اهتمام كبير في الأبحاث السريرية على MM1. تشمل انحرافات أجهزة الكمبيوتر التي تم اختبارها في لوحة التهجين الفلوري في الموقع (FISH) من نخاع العظم (BM) del 13q14 (RB1) و del 17p13 (TP53) و t(4;14) (IGH / FGFR3) و t (11;14) (IGH / MYEOV) و t (14;16) (IGH / MAF) و t (14:20) (IGH / MAFB) و 1q21 (CKS1B) الكسب / التضخيم و 1p (CDKN2C) الحذف.
يجب تضمين علم الوراثة الخلوية الطوري القياسي في التقييم الأولي لمرضى MM. على الرغم من أن النمط النووي التقليدي ذو النطاق G يوفر فائدة تحليل الكروموسوم الكامل، إلا أن انخفاض العائد لهذه الطريقة يؤدي إلى العديد من النتائج السلبية الخاطئة2. تقليديا ، كان ينظر إلى أجهزة الكمبيوتر الشخصية على أنها غير قادرة إلى حد كبير على الانقسام لأنها منتجات المرحلة النهائية من تمايز الخلايا الليمفاوية B. هذا يجعل من الصعب الحصول على صور مقسمة. قد يكون التحليل الوراثي الخلوي المحسن في MM مع الثقافات طويلة الأجل (6 أيام) وتحفيز الثقافات بواسطة السيتوكينات طريقة واعدة لتحديد التشوهات الوراثية الخلوية في مرضى MM الذين تم تشخيصهم حديثا3. حتى عندما تم إطالة وقت الزرع إلى 6 أيام ، ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن تشوهات وراثية خلوية بدقة في 30٪ -50٪ من مرضى MM 4. علاوة على ذلك ، يتميز MM بانحرافات وراثية خلوية معقدة تعكس عدم تجانسه التنبؤي. ومع ذلك ، فإن دقة تقنية ربط الكروموسومات التقليدية منخفضة ، مما قد يؤدي بسهولة إلى عدم اكتشاف تشوهات الكروموسومات في MM.
لا غنى عن FISH Interphase ، ويفضل بعد فرز الكمبيوتر الشخصي القائم على الخرز المغناطيسي الإيجابي CD138 أو وضع علامة عليه باستخدام سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي السيتوبلازمي κ / λ ، في تحليل MM5,6. يوصى بشدة باستخدام عينة مختارة إيجابية CD138 للحصول على العائد الأمثل للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، فإن الكمية الدقيقة للانحرافات الجينية الخلوية تتطلب ما لا يقل عن 4 مل من BM المضاد للتخثر لفرز الكمبيوتر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مجموعات فرز الخرزة المناعية المغناطيسية CD138 مع FISH أو الغلوبولين المناعي لسلسلة الضوء κ / λ السيتوبلازمية مع اختبار FISH (cIg-FISH) تزيد من العديد من التكاليف التجريبية وتستغرق وقتا طويلا.
عادة ، يتم تقييم نسبة الكمبيوتر الشخصي أولا من الفحص المورفولوجي لمسحات BM الملطخة أو أقسام خزعة BM 7,8. تستخدم عينات BM ذات الجودة العالية (عينات شفط النخاع الأولى) للاختبار المورفولوجي ، في حين أن العينات المرسلة ل FISH أو الكشف الآخر غالبا ما تكون عينات الشفط الثانوية ذات نسب عالية من التخفيف بالدم المحيطي.
في وقت مبكر من 1990s ، أظهرت دراسات متعددة أن مسحات BM يمكن استخدامها مباشرة لفحوصات FISH الخلالية ، والتي أثبتت أنها طريقة موثوقة وقابلة للتكرار 9. أكدت دراسة أنيقة تستند إلى مورفولوجيا الخلايا والكيمياء الخلوية الإستراز جنبا إلى جنب مع FISH من الدم المحيطي ومسحات BM أهميتها السريرية الكبيرة لتوضيح تشوهات الكروموسومات في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم المحبب واللمفاوي 10.
هنا ، نقدم طريقة جديدة لتحسين نجاح الكشف عن FISH بين المراحل في مرضى MM.
Protocol
Representative Results
Discussion
ومن الضروري تطبيق FISH على التقسيم الطبقي للمخاطر الجينية في MM. الجزء الحاسم من تقارير FISH ليس كل الخلايا النواة ، ولكن أجهزة الكمبيوتر النسيلة التي تم تنقيتها أو تحديدها على وجه التحديد عن طريق الفرز باستخدام الخرز المغناطيسي المضاد ل CD138 أو وضع علامة باستخدام سلسلة ضوء الغلوبولين المناعي ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا المشروع من قبل صندوق الابتكار التابع ل WNLO 2018WNLOKF023.
Materials
| automatic FISH machine | Leica Corporation | S500-24 | FINAL Assy Thermobrite 240V |
| DAPI | Abbott Molecular Inc. | 06J49-001 | DAPI Counterstain |
| FISH Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | FISH Analysis Software |
| FISH Probe | Abbott Molecular Inc. | 05N56-020 | Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit |
| Fixed volume pipette | Eppendorf China Ltd. | M33768H | 10 microliter |
| Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | BX53 | Forward Fluorescence Microscope |
| Karyotype Analysis Software | IMSTAR Corporation | IMSTAR | Karyotype Analysis Software |
| Light Microscope | Olympus Corporation | BX41 | Forward Light Microscope |
| NP-40 | Abbott Molecular Inc. | 07J05-001 | NP-40 |
| Plastic staining dyeing rack | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-501 | 24 slides |
| Plastic staining dyeing tank | Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd. | RSJ-516 | 24 slides |
| Rubber Cement | Marabu GmbH & Co. KG | FixoGum | Rubber Cement |
| SSC | Abbott Molecular Inc. | 02J10-032 | 20×SSC |
| Water bath | Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd. | DK-8D | Multiple Temperature Water bath |
References
- Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
- Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
- Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
- Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
- Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
- Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma – A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
- Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
- Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30 (2010).
- Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
- Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
- Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
- Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
- McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry’s Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
